経験的に抗生物質を処方する際には、細菌耐性の発現を防ぐために、適切な抗菌薬を選択する上で、感染性病原体を適時に特定することが非常に重要です。グラム染色は、患者から採取したあらゆる種類の材料(喀痰、気管支肺胞洗浄液など)を染色し、感染性病原体を迅速かつ大まかに特定する最も一般的な方法です。
グラム染色された喀痰塗抹標本の細菌検査により、可能性のある病原体の予備評価が行われます。グラム染色された喀痰塗抹標本は、培養に適しているかどうかの評価や、可能性のある病原体を特定するためにも、栄養培地に接種する前に検査されます。顕微鏡下で低倍率でグラム染色された塗抹標本中に白血球が 25 個以上、上皮細胞が 10 個未満しか見つからない場合、喀痰は培養に適していると判断されます。培養に使用できる高品質の喀痰検体の兆候としては、上皮細胞よりも白血球が優勢であること、および白血球の内部または周囲に 1 種類の細菌が存在することが挙げられます。標本中のグラム陽性細菌は濃い青色で、グラム陰性細菌はピンク色で表示されます。非定型肺炎の原因菌(マイコプラズマ、レジオネラ、リケッチア、クラミジア)はグラム染色では染色されないため、それらの検出には主に血清学的手法が使用されます。
ツィール・ニールゼン法による喀痰塗抹標本は、抗酸菌、特に結核菌の同定に用いられます。この標本は、4~6箇所から採取した喀痰の膿性粒子から作製されます。採取した粒子は、均一な塊になるまで2枚のスライドガラスの間で慎重に粉砕し、空気中で乾燥させた後、バーナーの炎で固定します。結核菌は赤色に染色され、その他の喀痰および細菌の成分は青色に染色されます。結核菌は、長さの異なる、細くわずかに湾曲した棒状の外観をしており、端部または中央部が肥厚しており、集団または単独で存在します。結核菌の検出は、結核性肺疾患の最も信頼できる兆候です。活動性肺結核に対する Ziehl-Neelsen 塗抹染色法の感度は 50%、特異度は 80~85% です。