肺炎球菌感染症は、病変部または血液から病原体が分離された場合にのみ、正確に診断できます。大葉性肺炎の場合は喀痰、敗血症の疑いがある場合は血液、その他の疾患の場合は膿性分泌物または炎症性滲出液を検査のために採取します。病理学的材料は顕微鏡検査にかけられます。莢膜に囲まれたグラム陽性の披針形双球菌の検出は、肺炎球菌感染症の予備診断の基礎となります。分離された双球菌が肺炎球菌に属するかどうかを確認するために、すべての肺炎球菌血清型に対する高力価の抗体を含む混合型特異的血清が使用されます。肺炎球菌性髄膜炎の初期段階では、病原体は脳脊髄液中に検出され、細胞外および細胞内に存在します。
純粋培養を分離するために、研究対象となる材料を血液、血清、または腹水寒天培地に播種します。栄養培地上では、肺炎球菌は小さな透明なコロニーを形成します。生物学的サンプルを用いて純粋培養を分離することも可能です。この目的で、白色マウスに研究対象となる材料を腹腔内感染させます。材料中に病原性肺炎球菌が存在する場合、マウスは24~48時間以内に死亡します。肺炎球菌抗原の検出には、固相免疫電気泳動法とPCR法が用いられます。