造血幹細胞

間葉系前駆細胞などの造血幹細胞（HSC）は多分化によって特徴付けられた細胞株、血液細胞および免疫系のいくつかの特殊な組織細胞を形成する有限要素を生じています。

A. Maximov（1909）が所有するすべての血液細胞の共通の祖先の存在の仮説と同様に、用語「幹細胞」、GSK巨大から細胞塊の電位形成 - 。骨髄幹細胞は、末梢自身の血球を構成する10日目の細胞を作り出します。造血幹細胞の存在は、骨髄幹細胞を破壊する放射線被ばくの致死量を受けたマウスにおける造血の回復の実験で1961年に設立されました。順位 単一のクローン原性前駆細胞 - すなわち、同系骨髄細胞の移植ように致死的に照射動物造血の離散病巣は、ソースレシピエントの脾臓で検出されました。

その後、造血幹細胞が自己支持する能力が実証され、これは造血形成の間の造血機能を提供する。胚発生過程において、HSCは、造血器官の部位への移行に必要な高い遊走活性を特徴とする。HSCのこの特性は、オンジェンジェネシスにおいても保持されている - それらの一定した移動のために、免疫担当細胞のプールの永久的な更新が行われる。血液 - 組織障壁を介してGSK遊走、侵入の能力は、組織の成長およびクローン原性の移植は、造血系の障害に関連する疾患の数に骨髄移植細胞のための基礎を提供しました。

全ての幹細胞の資源と同様、造血幹細胞はそのニッチ（骨髄）に非常に少量しか存在しないため、割り当てにある程度の困難が生じます。免疫表現ヒトHSCは血流中に移行すると、免疫系の器官に定着または骨髄間質を再作成することが可能なCD34 + NK細胞として特徴付けられます。これは明らかに、GSKが最も未熟な骨髄細胞ではないことを理解すること、そしてdormantnye線維芽細胞SB34陰性の細胞を含む前駆体に由来している必要があります。これは、CD34の表現型を有する細胞は、CD34 +で自分の表現型を変更する血流を、入ることができることが判明したが、微小環境の影響を受けて骨髄中の復帰の移行は再びCD34陰性幹細胞要素になります。安静時に、CD34細胞は、パラクリン調節性間質シグナル（成長因子、サイトカイン）に応答しない。分化シグナルが造血および間葉前駆細胞の両方を形成するが、表現型CD34と増幅強度造血幹細胞を必要とする状況に応答します。造血は、骨髄間質のGSK細胞要素と直接接触マクロファージ、細網内皮細胞、骨芽細胞、間質線維芽細胞と細胞外マトリックスの複雑なネットワークを提示することによって行われます。骨髄間質フレームワーク - マトリックス又は造血組織のための「スケルトン」のみならず、それは、成長因子、サイトカインおよびケモカインのパラクリン調節シグナルに造血の微調整を搬送し、また、血液細胞の形成に必要な接着剤の相互作用を提供します。

したがって、絶えず更新される造血系の基礎は、造血幹細胞であり、自己維持を長期化させることができる。コミットの過程で、HSCは一次分化を受け、細胞形態および免疫表現型の特徴が異なる細胞のクローンを形成する。原始および確定された前駆細胞の連続形成は、種々の造血系の形態学的に同定可能な祖先細胞の形成によって完了する。赤血球、白血球、リンパ球および血小板 - 後段複雑な多段階プロセスの結果は、末梢血形成された素子に成熟した造血細胞及び収率の成熟です。

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造血幹細胞の供給源

造血幹細胞は、骨髄移植のための診療所での使用が主な原因である、最も研究された幹の供給源と考えられている。一見すると、これらの細胞について多くのことが知られています。ある程度中間および成熟子孫GSKので、これは、真である - 最も手頃な細胞要素、その各々（赤血球、白血球、リンパ球、単球/マクロファージおよび血小板）が完全すべてのレベルで研究されている - 光から電子顕微鏡に、から生化学的および免疫表現型の特徴をPCR分析によって同定する。ただし、監視は形態的、超微細構造的、生化学的、免疫表現、およびゲノムGSKの生物物理学的パラメータによって行わが、多くの問題の問題に対する答えが得られていない、の溶液は、細胞移植の発展のために必要です。機能的に異なる血液細胞、赤血球、白血球、リンパ球、および血小板のように教育へのコミットメントを - それは、対称または非対称分裂の段階を入力し、休止状態にGSK安定化メカニズムを確立していない、それらが活性化されたままで、そして最も重要なこと。

間葉系と造血幹細胞の両方の先祖あるCD34の表現型と骨髄細胞、中に存在することは、前駆細胞の分化および造血間質ラインにおけるCD34陰性細胞の最も初期の近くの存在の問題を提起しています。長期培養法は「細胞（ - LTC-ICの長期培養開始細胞）を開始いわゆる」長期培養することによって得ました。成長因子の組み合わせに基づいて、骨髄間質のコロニー形成活性のような前駆細胞の寿命はより5週間、わずか3週間の培養でコミットコロニー形成単位（CFU）のに対し、生存率です。表現型CD34 + CD38-を特徴とし、自己再生する高い能力を発揮している約20％のLTC-ICの高電位repopulyatsionnomとして機能アナログGCW - これは、現在LTC-ICと考えられています。しかし、1：50 000の周波数を用いたヒトの骨髄に見られるような細胞は、その培養の長期（15週間）の条件下で得られたHSCに最も近いlimfoidoinitsiiruyuschie、骨髄細胞を認識すべきです。ヒト骨髄細胞を10倍LTC-IC未満で発見され、そして骨髄細胞系およびリンパ系造血幹として形成されている間、そのような細胞は、LTCとして指定されます。

免疫表現型の同定に続いてモノクローナル抗体を用いた造血幹細胞の標識は、識別し、したがって限られた専用GSKの潜在的な臨床用途を有する造血幹細胞の選択的な選別のための主要な方法であるが。必然的に免疫ソーティング時CD34受容体抗体または他のマーカー抗原を遮断することで単離された細胞の性質を変化させます。磁気カラムでのHSCの免疫陰性分泌がより好ましい。しかし、この場合には、ソートは、通常、金属支持体上に固定されたモノクローナル抗体が、使用されています。また、重要なことは、GSKの割り当て方法の両方ではなく、機能的特徴よりも、表現型に基づきます。したがって、多くの研究者は、コロニーのサイズおよび組成は、成熟及び前駆細胞の分化の方向の程度を決定することを可能にするクローン原性パラメータGSKの分析を使用することを好みます。細胞の数とコロニー内の型の数をコミットする過程で低下することが知られています。造血幹細胞および「顆粒球赤血球単球megakariotsitokolonieobrazuyuschayaユニット」（SFU-GEMM）と呼ばれる初期のその娘細胞は、それぞれ、顆粒球、赤血球、単球および巨核球を含む培養マルチリニア大きなコロニーを作成します。成熟した顆粒球のわずかなコロニー - ライン顆粒球系統コミットメントmonotsitokolonieobrazuyuschayaユニット（SFU-GM）の下方に位置する顆粒球およびマクロファージ、および顆粒球コロニー形成単位（SFU-G）のコロニーを生成します。早期赤血球前身 - 赤血球のburstoobrazuyuschayaユニット（SFU-E）は、 - 小赤血球コロニー - 大きく、より成熟した赤血球コロニー形成単位（SFU-E）の供給源です。SFU-GEMM、GM-SFU、SFU-G、M-SFU、VFU-EおよびE-SFU）：一般集団では、半固体培地における細胞の増殖と骨髄コロニーの6種類を形成する細胞を同定することができます。

しかし、造血幹細胞に加えて、HSCの単離のための任意の原材料は、有意な数の付随する細胞を含む。これに関連して、最初に、ドナーの免疫系の活性細胞の移植片の予備精製が必要である。通常、特異的抗原のリンパ球発現に基づく免疫切片を使用して、モノクローナル抗体を用いて単離および除去することが可能である。加えて、CD4 +リンパ球と特異的モノクローナル抗体の複合体の形成に基づく技術immunorozetochnaya Tリンパ球枯渇した骨髄移植は、効率的にアフェレーシスを用いて除去します。この技術は、40〜60％の造血幹細胞を有する精製細胞材料を提供する。

ヒト免疫グロブリンで被覆されたナイロン繊維を含有するカラムを通して - 白血球搬出産物から成熟血液細胞の除去のために前駆細胞の数を増加する（クエン酸三ナトリウムキレート剤の存在下で）濾過し向流遠心分離することによって達成されます。赤血球の91％の - - これら二つの技術の連続使用は89％によって血小板から移植片の完全な洗浄を提供する白血球から。HSC損失の有意な減少のために、総細胞量中のCD34 +細胞のレベルは50％に増加することができる。

単離された造血幹細胞の機能特性については、培養中の成熟血液成分のコロニーを作成するそれらの能力が使用される。形成されたコロニーの分析は、前駆細胞のタイプ、それらのコミットの程度を識別し、定量化し、それらの分化の方向性を確立することを可能にする。クローン原性活性は、半固形培地、メチルセルロース、寒天、血漿又はフィブリンゲル、ガラスまたはプラスチックの表面への付着を防止、低減の細胞遊走活性が決定されます。最適な培養条件下では、単一細胞由来のクローンは7〜18日以内に発達する。クローン中に50個未満の細胞が存在する場合、細胞の数がコロニーとして50を超える場合、それは単一のクラスターとして同定される。コロニーを形成することができる細胞の数（コロニー形成単位-CFUまたはコロニー形成細胞-COC）が考慮される。それは再度、インビトロでHSCの官能性（コロニー形成）活性を同定する必要性を強調して、それが相関するが、パラメータおよびCFU COCは、細胞懸濁液中のHSCの数に対応していないことに留意すべきです。

造血幹細胞は、骨髄の細胞の中で増殖能が最も高く、これにより培養物中で最大のコロニーが形成される。そのようなコロニーの数によって、幹細胞の数を間接的に決定することが提案されている。直径0.5mmを超えるインビトロでコロニーを形成した後、細胞1000の数で、著者らは、5-フルオロウラシルの致死用量に対するこれらの細胞の安定性を試験し、骨髄致死的に照射された動物を再増殖する能力を検討しました。これらのパラメータによれば、単離された細胞はHSCと大きく異ならず、高い増殖能を有する略号HPP-CFCコロニー形成細胞を受けた。

造血幹細胞のより定性的な選択の可能性の探索が続けられている。しかし、幹造血細胞はリンパ球と形態学的に類似しており、ほぼ円形の核、細かく分散したクロマチンおよび弱い好塩基性の細胞質を有する比較的均質な細胞セットを代表する。正確な数も決定するのが難しい。人の骨髄におけるGSKは、核含有細胞106個につき1の頻度で発生すると考えられている。

造血幹細胞の同定

造血幹細胞の識別を改善するために、GSK表現型CD34 + CD38は分化マーカーの線形性の欠如、例えばCD4などの免疫担当細胞の特に抗原、及び表面免疫グロブリンと組み合わされるべき抗原の研究membrannosvyazannyhスペクトル、（マルチチャンネルソルビタンテレに）連続してまたは同時に行われますグリコホリン。

実際、造血幹細胞の表現型決定のすべてのスキームは、CD34抗原の決定を含む。いくつかのグリコシル化部位を有する約110kDaの分子量を有するこの糖タンパク質は、第1染色体上に位置する対応する遺伝子の活性化後に形質細胞膜上に発現される。骨髄間質基礎から初期造血前駆細胞のL-selektinoposredovannymの相互作用に関連したCD34分子機能。しかし、細胞表面上のCD34抗原の存在は、それが発現されるようにのみ、細胞懸濁液中のGSKのコンテンツの予備的評価を行うことができ、他の造血前駆細胞および骨髄間質細胞および内皮細胞のことを忘れてはなりません。

造血前駆細胞の分化の間、CD34発現は永久に減少する。赤血球、顆粒球および単球委託前駆細胞は、抗原CD34を弱く発現するか、またはそれらの表面上に全く存在しない（表現型CD34）。骨髄および成熟血液細胞の分化した細胞の表面膜上で、CD34抗原は検出されない。

造血前駆細胞の分化の動態にCD34の発現レベルを低下させるが、CD38抗原の徐々に増加した発現を平行でないだけことに留意すべきである - 内在性膜は、その関与を示唆し、NAD-glikogidrolaznoyおよびADP-リボシルシクラーゼ活性を有する46 kDaの分子量を有する糖タンパク質ADP-リボースの輸送および合成において重要である。したがって、ダブルチェックするために造血前駆細胞のコミットメントの度合いを可能です。表現型を有するCD34 + CD38細胞が役割GSKを請求することができるのに対し、90〜99％のCD34陽性骨髄細胞から表現型CD34 + CD38 +を有する細胞の集団は、限定されるもので増殖能および分化に前駆細胞を含みます。

実際、式CD34 + CD38-によって記載される骨髄細胞の集団は、骨髄系およびリンパ系の方向に分化することができる比較的多数の原始幹細胞を含む。好中球、好酸球、好塩基球、単球、巨核球、赤血球およびリンパ球：CD34 + CD38-細胞の表現型を有する長期培養のコンテキスト内のすべての成熟血液細胞を得るために管理します。

AC133及びCD90（Thyの-1）、造血幹細胞を同定するために使用されている - は比較的最近では、CD34陽性細胞は、2つの以上のマーカーを発現することを見出しました。Thy-1抗原は、骨髄、臍帯および末梢血のCD34 +細胞上の受容体CD117（C-KIT）と共発現されます。細胞接着プロセスに関与している25〜35 kDaの分子量を有する糖タンパク質本fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy表面。一部の著者は、汝-1抗原は、最も未熟CD34陽性細胞のマーカーであると考えています。CD34 +のThy-1 +娘細胞を形成するために、長期培養株を生じさせるの表現型を有する細胞を複製します。それは汝-1抗原ブロック細胞分裂を停止する原因となる調節シグナルと想定されます。CD34 + TU1 +細胞は自己再生および長期培養株の作成が可能であるCD34陽性細胞の元素の合計重量のThy-1 +含有量がはるかに超えて、約50％であるように、それらの表現型は、HSCのみに関連することができないという事実にもかかわらず造血細胞の数。

造血幹細胞の同定に関してより有望なのは、造血前駆細胞の抗原マーカーであるAC133であり、その発現は胚性肝細胞で最初に検出された。AC133は、GSK成熟の最も初期の段階で細胞膜の表面上に現れる膜貫通糖タンパク質であり、抗原CD34よりも早くても可能である。A. PetrenkoおよびV. Grishchenko（2003）の研究では、AC133が胚性肝臓のCD34陽性細胞の30％までを発現することが判明した。

したがって、今日の概念による造血幹細胞の理想的な表現型プロファイルは、本CD34なければならない回路のセル輪郭の合計は、構成、AC133とのThy-1抗原が、分子突起CD38のための場所が存在しない、HLA-DRマーカー線形分化GPA 、CD3、CD4、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20。

GSK表現型変化の肖像画は、この式によって記述される細胞の特性は、表現型CD34 + CD38を有する細胞の機能パラメータと異ならないので、CD34 + CD45RalowCD71lowの組み合わせであってもよいです。完全に致死的に照射されたマウスにおける造血を回復するこれらの細胞のわずか30 - また、ヒトHSCは+ CD38Iow /「のc-kit /低い表現型標識CD34 +のThy-Lによって同定することができます。

骨髄細胞の一般的な表現型特性の分析から、実際に造血系の様々な病態を治療するための骨髄移植の使用を正当化することができ、他の細胞要素への自己複製と分化の両方を同時にできる集中的な研究GSKの40年間を開始しました。最近発見された新しいタイプの幹細胞は、臨床的実践においてまだ広く使用されていない。しかし、臍帯（コード）は、血液および胎児の肝臓からの細胞が大幅に定量的性能と品質特性としてHSCの骨髄から異なるとして、血液中だけでなく、医学の他の分野だけでなく細胞移植を拡張することができます幹。

移植に必要な幹造血細胞塊の体積は、通常、骨髄、末梢血および臍帯血、ならびに胚性肝臓から得られる。さらに、造血前駆細胞は、造血細胞要素へのそれらの指向性分化の後のESCの増殖によってin vitroで得ることができる。A.ペトレンコ、V. Grishchenko（2003）は正しく原因の早期多能性のそのソースに含まれる不均等な比率以降コミット前駆細胞に、有意差免疫学的特性および造血GSK異なる起源を復元する機能を指摘しています。さらに、異なる幹供給源に由来する造血幹細胞は、非造血細胞と定量的および定性的に全く異なる会合を有する。

造血幹細胞の伝統的な供給源は骨髄である。骨髄細胞の懸濁液は、局所麻酔下で浸出することによって、腹部の骨または胸骨から得られる。このようにして得られた懸濁液は、不均一であり、HSC、間質細胞要素、骨髄系およびリンパ系のコミットされた前駆細胞、ならびに成熟血液要素の混合物を含有する。骨髄単核細胞の表現型CD34 +およびCD34 + CD38を有する細胞の数は、それぞれ0.5〜3.6および0〜0.5％である。G-CSF誘導HSCの動員後の末梢血は、0.4〜1.6％のCD34 +および0〜0.4％のCD34 + CD38を含む。

より高いCD34 + CD38の免疫およびCD34 +臍帯血を有する細胞のパーセンテージ - および0から0.6 OD-2.6％、及びそれらの最大数は、造血性胎児肝細胞のうち、検出された - および2,3- 0,2-12,5 -35.8％となった。

しかしながら、グラフト材料の品質は、その中にCD34 +細胞の含有量ではなく、（致死的に照射動物における骨髄の再増殖）in vivoでのコロニー形成のレベルによって推定することができ、それらの機能活性、およびin vitroだけでなく依存 - 半固形培地上でのコロニーの増殖。これは、コロニー形成および胎児肝臓、胎児骨髄及び臍帯血から単離された表現型CD34 + CD38、HLA-DR、を有する造血前駆細胞の増殖活性、および著しく成人の骨髄および末梢血の造血コロニー形成細胞の増殖能力を超えていることが判明しました。GSK異なる起源の定量及び定性分析は、それらの相対的な細胞懸濁液中のコンテンツ、および機能の有意差を明らかにしました。胎児骨髄由来のグラフト材料において観察されたCD34 +細胞（24.6％）の最大数。成人ヒトの骨髄は、CD34陽性細胞要素の2.1％を含有する。臍帯血その量が2％に達するのに対し、成人末梢血の単核細胞のうちわずか0.5％が、表現型CD34の+を有します。従って2.7倍胎児骨髄のCD34 +細胞のコロニー形成能は、成人ヒト細胞および臍帯血細胞の造血骨髄のクローン増殖の容量を超える成人の末梢血から単離された造血要素よりもかなり大きいコロニー形成：40 65.5および、8コロニー/ 105細胞である。

造血幹細胞の増殖活性およびコロニー形成能の差は、成熟度の違いだけでなく、それらの自然の微環境にも関連する。幹細胞の増殖および分化の強度は、幹細胞とマトリックスの間質微小環境の細胞要素の両方によって産生される成長因子およびサイトカインの多成分系の積分規制影響によって決定される速度ことが知られています。特定の直線方向にコミットの特徴づけ種々のレベルの幹細胞上の刺激と阻害効果を有する成長因子、前駆細胞と細胞を与える細胞培養を視野に精製された細胞集団および無血清培地を使用して。これらの研究の結果は、個体発生発達の異なるレベルの供給源に由来するHSCは、両方の表現型および機能的に異なることを示しています。GSKについては、自己複製および高い増殖活性の高い可能性を特徴とする個体発生の初期段階にとどまる。そのような細胞は、より長いテロメア長によって区別され、全ての造血細胞株の形成を伴ってコミットされる。このような細胞は軽度にHLA分子を発現するので、免疫系とHSC胚起源との反応は遅れる。HSCおよび自己再生、彼らは約束の種類を構成するラインの数に能力の相対的な内容の明確なグラデーションがあります：骨髄の臍帯血> CD34 +細胞の胎児肝臓> CD34 +細胞のCD34 +細胞。ドナーの年齢に反比例し、骨髄または成人の末梢血由来のHSCの形成活性を増殖能およびコロニー - このような違いが細胞内に固有と人間開発のネオpostanatalnomu早い時期でなく、個体発生全体ではないことが重要です。