造血幹細胞

造血幹細胞（HSC）は、間葉系前駆細胞と同様に、多分化能を特徴とし、細胞株を生み出します。その最終要素は血液の形成要素や、免疫系のいくつかの特殊組織細胞を形成します。

すべての血液細胞に共通の前駆細胞が存在するという仮説、そして「幹細胞」という用語自体は、A. マクシモフ（1909）によるものです。HSCにおける細胞塊形成の可能性は非常に大きく、骨髄幹細胞は末梢血の形成要素となる細胞を毎日10個生成します。造血幹細胞の存在は、1961年に、骨髄幹細胞を破壊する致死量の放射線照射を受けたマウスの造血回復実験で確立されました。このように致死量の放射線照射を受けた動物に同系の骨髄細胞を移植したところ、レシピエントの脾臓に、単一のクローン形成性前駆細胞を起源とする、明確な造血巣が見つかりました。

その後、個体発生過程において造血機能を果たす造血幹細胞の自己維持能力が証明されました。胚発生過程において、造血幹細胞は造血器官形成領域への移動に必要な高い遊走能を特徴としています。この造血幹細胞の特性は個体発生においても維持され、その絶え間ない遊走により、免疫担当細胞プールの永続的な更新が起こります。造血幹細胞の遊走能、組織血球バリアの貫通能、組織への移植能、そしてクローン形成増殖能は、造血系の病理に関連する多くの疾患における骨髄細胞移植の基盤となりました。

すべての幹細胞リソースと同様に、造血幹細胞はそのニッチ（骨髄）に非常に微量しか存在しないため、分離には一定の困難が生じます。免疫表現型的には、ヒトHSCは、血流に移行して免疫系の臓器に分布したり、骨髄間質に再分布したりすることができるCD34+NK細胞として特徴付けられます。HSCは骨髄の最も未熟な細胞ではなく、休眠中の線維芽細胞様CD34陰性細胞を含む前駆細胞に由来することを明確に理解する必要があります。CD34表現型の細胞は全身の血流に入り、そこで表現型がCD34+に変化するが、骨髄に逆移動すると、微小環境の影響を受けて再びCD34陰性の幹細胞要素になることが立証されています。静止状態において、CD34⁻⁻細胞は間質からの傍分泌調節シグナル（成長因子、サイトカイン）に反応しません。しかし、造血の増強が求められる状況では、CD34表現型を持つ幹細胞が分化シグナルに反応し、造血幹細胞と間葉系前駆細胞の両方を形成します。造血は、マクロファージ、網状内皮細胞、骨芽細胞、間質線維芽細胞、細胞外マトリックスからなる複雑なネットワークに代表される骨髄間質の細胞要素とHSCが直接接触することで起こります。骨髄間質基質は、造血組織の単なるマトリックス、あるいは「骨格」ではありません。成長因子、サイトカイン、ケモカインといった傍分泌調節シグナルによって造血を細かく調節するだけでなく、血液細胞の形成に必要な接着相互作用も提供します。

このように、絶えず更新される造血システムは、長期的な自己維持能力を持つ多能性（造血の観点から）の造血幹細胞に基づいています。コミットメントの過程において、HSCは一次分化を経て、細胞形態学的および免疫表現型的特性が異なる細胞のクローンを形成します。原始的前駆細胞とコミットメントされた前駆細胞の連続的な形成は、様々な造血系における形態学的に識別可能な前駆細胞の形成で終わります。複雑な多段階造血過程のその後の段階の結果として、細胞は成熟し、成熟した形成成分（赤血球、白血球、リンパ球、血小板）が末梢血に放出されます。

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造血幹細胞の供給源

造血幹細胞は、骨髄移植における臨床応用を背景に、最も研究されている幹細胞源と考えられています。一見すると、これらの細胞については非常に多くのことが分かっているように見えます。ある程度は確かにその通りです。なぜなら、造血幹細胞の中間体および成熟した子孫は最もアクセスしやすい細胞要素であり、それぞれ（赤血球、白血球、リンパ球、単球／マクロファージ、血小板）が、光学顕微鏡から電子顕微鏡まで、生化学的および免疫表現型的特性からPCR分析法による同定まで、あらゆるレベルで綿密に研究されてきたからです。しかしながら、造血幹細胞の形態学的、超微細構造的、生化学的、免疫表現型的、生物物理学的、およびゲノム的パラメータのモニタリングは、細胞移植学の発展に不可欠な多くの難問に対する答えを提供していません。休眠状態にある造血幹細胞の安定化、活性化、対称分裂または非対称分裂段階への移行、そして最も重要な、赤血球、白血球、リンパ球、血小板などの機能的に異なる血液成分の形成へのコミットメントのメカニズムはまだ確立されていません。

骨髄中に間葉系幹細胞と造血幹細胞の両方の祖先であるCD34表現型の細胞が存在することから、CD34陰性細胞に近い、間質系および造血系への細胞分化の最も初期の前駆細胞が存在するのではないかという疑問が生じました。いわゆる長期培養開始細胞（LTC-IC）は、長期培養法を用いて得られました。特定の成長因子の組み合わせを用いた骨髄の間質基質上でコロニー形成活性を示すこのような前駆細胞の寿命は5週間を超えますが、培養中のコミットコロニー形成単位（CFU）の生存率はわずか3週間です。現在、LTC-ICはHSCの機能的類似体であると考えられています。これは、高い再増殖能を持ち、約20%のLTC-ICがCD34 + CD38-表現型を特徴とし、高い自己複製能力を示すためです。このような細胞はヒト骨髄中に1/50,000の頻度で存在します。しかし、長期（15週間）培養条件下で得られる骨髄リンパ球系分化誘導細胞（LTC）は、造血幹細胞（HSC）に最も近い細胞として認識されるべきです。LTCと呼ばれるこのような細胞は、ヒト脳の骨髄細胞の一つであり、LTC-ICよりも10倍低い頻度で存在し、骨髄系とリンパ系の両方の造血系細胞株を形成します。

造血幹細胞をモノクローナル抗体で標識し、免疫表現型同定を行う方法は、造血幹細胞の潜在能力を持つ細胞を識別・選択的に選別する主な方法ですが、このようにして単離された造血幹細胞の臨床応用は限られています。免疫陽性選別において、CD34受容体やその他のマーカー抗原を抗体でブロックすると、単離された細胞の特性が必然的に変化します。磁気カラムを用いた造血幹細胞の免疫陰性分離は、より好ましいと考えられています。しかし、この場合、選別には通常、金属担体に固定されたモノクローナル抗体が使用されます。さらに、重要な点として、どちらの造血幹細胞単離法も、機能特性ではなく表現型特性に基づいています。そのため、多くの研究者は、コロニーの大きさと構成から前駆細胞の成熟度と分化方向を決定できる、造血幹細胞のクローン形成パラメータの分析を好んで用います。コミットメントの過程では、コロニー内の細胞数とその種類が減少することが知られています。造血幹細胞とその初期の娘細胞は、「顆粒球-赤血球-単球-巨核球コロニー形成単位」（CFU-GEMM）と呼ばれ、培養するとそれぞれ顆粒球、赤血球、単球、巨核球を含む大規模な多系統コロニーを形成します。コミットメントラインの下流に位置する顆粒球-単球コロニー形成単位（CFU-GM）は、顆粒球とマクロファージのコロニーを形成し、顆粒球コロニー形成単位（CFU-G）は成熟した顆粒球の小さなコロニーのみを形成します。初期の赤血球前駆細胞である赤血球バースト形成単位（CFU-E）は、大きな赤血球コロニーの源であり、より成熟した赤血球コロニー形成単位（CFU-E）は、小さな赤血球コロニーの源です。一般に、半固形培地上で細胞が増殖すると、CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M、BFU-E、CFU-E の 6 種類の骨髄コロニーを形成する細胞を識別できます。

しかし、造血幹細胞（HSC）を分離するためのあらゆる原料には、造血誘導物質に加えて、相当数の随伴細胞が含まれています。そのため、まずドナーの免疫系の活性細胞から移植片を予備的に精製する必要があります。通常、この目的のために、リンパ球による特異的抗原の発現に基づく免疫選択法が用いられ、モノクローナル抗体を用いて抗原を分離・除去することが可能です。さらに、CD4+リンパ球と特異的モノクローナル抗体の複合体形成に基づき、アフェレーシスを用いて効果的に除去する、骨髄移植におけるTリンパ球除去のための免疫ロゼット法が開発されました。この方法により、造血幹細胞含有量が40～60%の精製細胞材料を確実に得ることができます。

白血球成分から成熟した血液成分を除去することで、前駆細胞数を増加させることができます。これは、向流遠心分離後、キレート剤（クエン酸三ナトリウム）存在下で、ヒト免疫グロブリンをコーティングしたナイロン繊維を含むカラムを用いて濾過することにより実現されます。この2つの方法を順次行うことで、移植片から血小板を完全に精製することができ、赤血球は89%、白血球は91%の精製率が得られます。造血幹細胞の損失が大幅に減少するため、全細胞量中のCD34陽性細胞の割合を50%まで増加させることができます。

分離された造血幹細胞が培養中に成熟血液細胞のコロニーを形成する能力は、細胞の機能的特徴づけに利用されます。形成されたコロニーを分析することで、前駆細胞の種類、その関与度、分化の方向を特定・定量化することができます。クローン形成活性は、メチルセルロース、寒天、血漿、またはフィブリンゲル上の半固形培地で測定されます。これらの培地は細胞の移動活性を低下させ、ガラスやプラスチックの表面への付着を防ぎます。最適な培養条件下では、7～18日で単一細胞からクローンが発達します。クローンに含まれる細胞数が50個未満の場合は単一クラスターと識別され、細胞数が50を超える場合はコロニーと識別されます。コロニーを形成できる細胞数（コロニー形成単位 - CFUまたはコロニー形成細胞 - COC）が考慮されます。 CFU と COC のパラメータは細胞懸濁液中の HSC の数と相関関係にあるものの、それに対応するものではないことに注意する必要があります。このことからも、in vitro での HSC の機能的 (コロニー形成) 活性を決定する必要性が改めて強調されます。

骨髄細胞の中で、造血幹細胞は最も高い増殖能を有しており、培養において最も大きなコロニーを形成します。このようなコロニーの数から、幹細胞の数を間接的に推定することが提案されています。著者らは、試験管内で直径0.5 mmを超え、細胞数が1000個を超えるコロニーを形成させた後、これらの細胞の亜致死量の5-フルオロウラシルに対する耐性を試験し、致死量の放射線を照射された動物の骨髄を再増殖させる能力を研究しました。指定されたパラメータによれば、分離された細胞はHSCとほぼ区別がつかず、HPP-CFC（高増殖能コロニー形成細胞）という略語が付与されました。

造血幹細胞のより高品質な分離法の開発は継続されています。しかしながら、造血幹細胞はリンパ球と形態学的に類似しており、ほぼ円形の核、細かく分散したクロマチン、そして少量の弱好塩基性の細胞質を持つ、比較的均質な細胞群です。その正確な数を特定することも困難です。ヒト骨髄中の造血幹細胞は、有核細胞106個あたり1個の割合で存在すると推定されています。

造血幹細胞の同定

造血幹細胞の識別品質を向上させるには、膜結合抗原のスペクトルの連続的または同時（マルチチャネルソーター上）研究が行われ、HSC では、CD34 + CD38 表現型を、特に CD4、表面免疫グロブリン、グリコフォリンなどの免疫担当細胞の抗原などの線形分化マーカーの欠如と組み合わせる必要があります。

ほぼすべての造血幹細胞表現型解析計画には、CD34抗原の測定が含まれています。分子量約110 kDaのこの糖タンパク質は、複数のグリコシル化部位を有し、1番染色体に位置する対応する遺伝子の活性化後に形質細胞膜上に発現します。CD34分子の機能は、L-セレクチンを介した初期造血前駆細胞と骨髄間質基質との相互作用に関連しています。しかし、CD34抗原は他の造血前駆細胞だけでなく、骨髄間質細胞や血管内皮細胞にも発現しているため、細胞表面上のCD34抗原の存在は、細胞懸濁液中のHSC含量の予備的な評価にしか役立たないことに留意する必要があります。

造血前駆細胞の分化過程において、CD34の発現は恒久的に低下します。赤血球、顆粒球、および単球系分化前駆細胞は、CD34抗原を弱く発現するか、表面に全く発現しません（CD34表現型）。CD34抗原は、分化した骨髄細胞および成熟血液細胞の表面膜では検出されません。

造血前駆細胞の分化ダイナミクスにおいて、CD34の発現レベルが低下するだけでなく、NADグリコヒドロラーゼおよびADPリボシルシクラーゼ活性を有する分子量46 kDaの膜貫通型糖タンパク質であるCD38抗原の発現も徐々に増加していることに注目すべきである。これは、CD38がADPリボースの輸送と合成に関与していることを示唆している。したがって、造血前駆細胞の分化度を二重に制御できる可能性がある。CD34陽性骨髄細胞の90～99%を占めるCD34+CD38+表現型の細胞集団には、増殖能および分化能が限られた前駆細胞が含まれるが、CD34+CD38表現型の細胞はHSCの役割を果たすことができる。

実際、CD34+CD38-という式で表される骨髄細胞集団には、骨髄系およびリンパ系への分化能を持つ原始的幹細胞が比較的多く含まれています。CD34+CD38-表現型を持つ細胞を長期培養することで、好中球、好酸球、好塩基球、単球、巨核球、赤血球、リンパ球といった、血液中のあらゆる成熟した細胞群を得ることができます。

比較的最近、CD34陽性細胞が、造血幹細胞の同定にも用いられるAC133とCD90（Thy-1）という2つのマーカーを発現していることが立証されました。Thy-1抗原は、骨髄、臍帯、末梢血のCD34陽性細胞上で、CD117受容体（c-kit）と共発現しています。Thy-1抗原は、分子量25～35 kDaの表面ホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質であり、細胞接着過程に関与しています。一部の研究者は、Thy-1抗原が最も未熟なCD34陽性細胞のマーカーであると考えています。CD34+Thy-1+表現型を有する自己複製細胞は、娘細胞の形成を伴う長期培養細胞株を生み出します。Thy-1抗原は、細胞分裂停止を引き起こす制御シグナルを阻害すると考えられています。 CD34+Thy1+ 細胞は自己複製が可能で、長期培養細胞株を作成できるにもかかわらず、CD34 陽性細胞要素の総量における Thy-1+ の含有量が約 50% であり、造血細胞の数を著しく上回っているため、その表現型を HSC のみに帰することはできません。

造血幹細胞の同定において、より有望なのはAC133です。これは造血前駆細胞の抗原マーカーであり、その発現は胎児肝細胞で初めて検出されました。AC133は膜貫通糖タンパク質であり、HSC成熟の最も初期段階、つまりCD34抗原よりもさらに早い段階で細胞膜表面に発現する可能性があります。A. Petrenko、V. Grishchenko (2003) の研究では、AC133はCD34陽性胎児肝細胞の最大30%で発現していることが確認されています。

したがって、現在の概念によれば、造血幹細胞の理想的な表現型プロファイルは細胞の輪郭で構成され、その輪郭には CD34、AC133、および Thy-1 抗原の構成が含まれますが、CD38、HLA-DR、および線形分化マーカー GPA、CD3、CD4、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20 の分子投影のための余地はありません。

造血幹細胞（HSC）の表現型のバリエーションとして、CD34+CD45RalowCD71lowの組み合わせが挙げられます。この式で表される細胞の特性は、CD34+CD38表現型を持つ細胞の機能パラメータと変わらないためです。さらに、ヒト造血幹細胞はCD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/lowという表現型特性によって識別できます。致死量の放射線照射を受けたマウスにおいて、このような細胞が造血を完全に回復させるのはわずか30個です。

自己複製能と他の細胞成分への分化能を持つ造血幹細胞（HSC）に関する40年にわたる集中的な研究は、骨髄細胞の一般的な表現型特性の解析から始まり、造血系の様々な病態に対する骨髄移植の適用を正当化するに至りました。その後発見された新しいタイプの幹細胞は、まだ臨床現場で広く利用されていません。一方で、臍帯血および胎児肝由来の幹細胞は、骨髄HSCとは量的特性と質的特性の両方において異なるため、血液学だけでなく他の医学分野においても細胞移植の規模を大幅に拡大する可能性があります。

移植に必要な造血幹細胞量は、通常、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝から得られます。さらに、ES細胞を増殖させ、その後造血細胞へと分化誘導させることで、体外で造血前駆細胞を得ることができます。A. Petrenko、V. Grishchenko (2003) は、由来の異なるHSCの免疫学的特性と造血回復能力に大きな違いがあることを正しく指摘しています。これは、それぞれの由来に含まれる初期多能性前駆細胞と後期分化前駆細胞の比率が不均等であることに起因します。さらに、異なる幹細胞由来の造血幹細胞は、非造血細胞の組成が量的にも質的にも全く異なるという特徴があります。

骨髄は既に造血幹細胞の伝統的な供給源となっています。骨髄細胞懸濁液は、局所麻酔下で腸骨または胸骨から洗浄することで得られます。このようにして得られた懸濁液は不均一であり、造血幹細胞（HSC）、間質細胞成分、骨髄系およびリンパ系の分化前駆細胞、そして成熟した血液成分が混在しています。骨髄単核細胞中のCD34+およびCD34+CD38表現型を持つ細胞の数は、それぞれ0.5～3.6%および0～0.5%です。G-CSF誘導による造血幹細胞動員後の末梢血には、CD34+が0.4～1.6%、CD34+CD38が0～0.4%含まれています。

臍帯血では、免疫表現型 CD34+CD38 および CD34+ を持つ細胞の割合が高く (それぞれ 0～0.6%、1～2.6%)、胎児肝臓の造血細胞ではその最大数が検出され (それぞれ 0.2～12.5%、2.3～35.8%) ます。

しかし、移植材料の品質は、そこに含まれるCD34+細胞の数だけでなく、その機能活性にも依存します。これは、in vivo（致死的放射線照射を受けた動物の骨髄の再増殖）でのコロニー形成レベル、およびin vitro（半液体培地でのコロニー増殖）で評価できます。胎児肝臓、胎児骨髄、臍帯血から分離されたCD34+CD38 HLA-DR表現型を持つ造血前駆細胞のコロニー形成および増殖活性は、成人の骨髄と末梢血の造血細胞の増殖およびコロニー形成能を大幅に上回ることが判明しました。さまざまな起源のHSCの定量的および定性的な分析により、細胞懸濁液中の相対含有量と機能的能力の両方に大きな違いがあることが明らかになりました。CD34+細胞の最大数（24.6％）は、胎児骨髄から得られた移植材料で確認されました。成人の骨髄には、CD34陽性細胞成分が2.1%含まれています。成人の末梢血単核細胞のうち、CD34陽性表現型を示す細胞はわずか0.5%ですが、臍帯血ではその数は2%に達します。同時に、胎児骨髄中のCD34陽性細胞のコロニー形成能は、成人の骨髄造血細胞のクローン増殖能の2.7倍高く、臍帯血細胞は成人の末梢血から単離された造血成分よりも有意に多くのコロニーを形成します（それぞれ65.5コロニー/105細胞と40.8コロニー/105細胞）。

造血幹細胞の増殖活性およびコロニー形成能の違いは、成熟度の違いだけでなく、自然微小環境にも関連しています。幹細胞の増殖強度および分化速度は、幹細胞自身とマトリックス間質微小環境の細胞成分の両方から産生される成長因子およびサイトカインからなる多成分系の統合的な制御作用によって決定されることが知られています。精製細胞集団と無血清培地を用いた細胞培養により、様々なレベルの幹細胞、前駆細胞、そして何らかの直線方向へ誘導された細胞に対して刺激作用および阻害作用を持つ成長因子を特徴付けることが可能になりました。これらの研究結果は、個体発生段階の異なる供給源から得られたHSCが、表現型および機能の両方において異なることを説得力を持って示しています。個体発生の初期段階にあるHSCは、高い自己複製能と高い増殖活性を特徴としています。このような細胞は、より長いテロメアによって区別され、すべての造血細胞株を形成するためのコミットメントを受ける。胚起源のHSCに対する免疫系の反応は、HLA分子の発現が弱いため遅延する。HSCの相対的含有量、自己複製能力、およびそれらが形成するコミットメントラインの種類の数には明確な段階があり、胎児肝臓のCD34+細胞>臍帯血のCD34+細胞>骨髄のCD34+細胞である。このような違いは、ヒトの発達における出生中、出産後、および早期出生期に固有のものであるだけでなく、個体発生全体にも固有のものであることが重要である。成人の骨髄または末梢血から得られたHSCの増殖およびコロニー形成活性は、ドナーの年齢に反比例する。