遺伝性疾患診断のための分子遺伝学的手法

DNAテクノロジーは、特定の遺伝性疾患の原因となる変異遺伝子の特定の染色体における局在を決定するために使用されます。遺伝子はDNAの一部であり、遺伝子変異はDNAの一次構造の損傷です（変異とは、その局在や個体の生存能力への影響に関わらず、DNA配列におけるあらゆる変化を指します）。したがって、遺伝性疾患患者の中期染色体標本をプローブで調べることで、病理学的遺伝子の局在を特定することが可能になります。分子遺伝学的手法は、DNA構造の変化レベルで疾患を診断する機会を生み出し、遺伝性疾患の局在を特定できるようにします。分子遺伝学的手法は、たった1塩基の置換に関連する変異でさえも特定できます。

遺伝子同定において最も重要な段階は、その単離です。DNAは、核を含むあらゆる種類の組織および細胞から単離できます。DNA単離の段階には、細胞の急速溶解、遠心分離による細胞小器官および膜の断片の除去、酵素によるタンパク質の分解とフェノールおよびクロロホルムを用いた溶液からの抽出、エタノール沈殿によるDNA分子の濃縮が含まれます。

遺伝子検査室では、DNAは主に白血球から分離されます。患者から採取した静脈血5～20mlを、抗凝固剤（ヘパリン）を加えた滅菌試験管に入れ、上記の手順に従って白血球を分離・処理します。

研究用材料を準備する次の段階は、厳密に特定の塩基配列を持つ領域でDNAを断片に「切断」することです。これは、細菌酵素である制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）を使用して実行されます。制限酵素は、二本鎖DNA分子内の4〜6ヌクレオチド、まれに8〜12ヌクレオチドの特定の配列を認識し、制限部位と呼ばれるこれらの配列の位置で分子を断片に分割します。結果として得られるDNAの制限断片の数は、制限部位の発生頻度によって決まり、断片のサイズは、元のDNA分子の長さに沿ったこれらの部位の分布の性質によって決まります。制限部位がより頻繁に配置されているほど、制限後のDNA断片は短くなります。現在、細菌由来の500種類以上の制限酵素が知られており、これらの酵素はそれぞれ独自の特定のヌクレオチド配列を認識します。将来的には、制限部位はDNAの遺伝子マーカーとして使用される可能性があります。制限酵素処理によって形成されたDNA断片は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって長さ順に並べることができ、分子量を測定することができます。通常、ゲル中のDNAは、特異的染色（通常は臭化エチジウム）と透過型紫外線によるゲルの観察によって識別されます。DNAが局在する部位は赤色で表示されます。しかし、ヒトの場合、DNAが複数の制限酵素処理を受けると、長さの異なる断片が多数形成されるため、電気泳動では分離できません。つまり、電気泳動上で個々のDNA断片を視覚的に識別することはできません（ゲル全体にわたって均一な染色が得られます）。したがって、このようなゲル内の目的のDNA断片を識別するには、標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法が使用されます。

DNA または RNA の 1 本鎖セグメントはどれも、相補鎖と結合 (ハイブリダイズ) することができ、グアニンは必ずシトシンに、アデニンはチミンに結合します。こうして二本鎖分子が形成されます。クローン遺伝子の 1 本鎖コピーを放射性標識で標識すると、プローブが得られます。プローブは DNA の相補セグメントを見つけることができ、オートラジオグラフィーを使用して簡単に識別できます。伸長した染色体の調製物に放射性プローブを加えると、遺伝子を特定の染色体上に局在させることができます。DNA プローブを使用すると、サザンブロッティング中に特定の領域を識別できます。検査対象の DNA セクションに正常な遺伝子が含まれている場合、ハイブリダイゼーションが発生します。異常なヌクレオチド配列が存在する場合、つまり対応する染色体構造に変異遺伝子が含まれている場合、ハイブリダイゼーションは発生せず、これにより病的な遺伝子の局在を特定できます。

DNAプローブを得るために、遺伝子クローニング法が用いられます。この方法の本質は、遺伝子または遺伝子の一部に対応するDNA断片をクローニング粒子（通常は細菌プラスミド（細菌細胞内に存在し、抗生物質耐性遺伝子を含む環状染色体外DNA））に挿入し、ヒト遺伝子が挿入されたプラスミドを持つ細菌を増殖させることです。プラスミド内での合成プロセスにより、ヒト遺伝子またはその一部を数十億コピー取得することができます。

得られた DNA コピーは、放射性標識または蛍光色素で標識され、研究対象の DNA 分子のプール内で相補的な配列を検索するためのプローブとして使用されます。

現在、遺伝子変異を診断するために DNA プローブを使用するさまざまな方法が存在します。

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