遺伝病の診断のための分子遺伝学的方法

ある種の遺伝病理学の起源を担う変異遺伝子の特定の染色体における局在を決定するために、DNA技術方法が使用される。遺伝子は、DNAセグメントおよび遺伝子突然変異であるので - DNAの一次構造への損傷（変異は全てDNA配列の変化にかかわらず、それらの位置および個々の生存能力に影響することによって理解されている）を中期患者染色体のプローブ調製物は、確立することができる疾患を継承しました病理学的遺伝子の局在化。分子遺伝学の方法は、変化したDNA構造のレベルで疾患を診断する機会を作り、遺伝性疾患の局在を見出すことを可能にする。分子遺伝学的方法は、単一塩基の置換に関連する突然変異を明らかにすることができる。

遺伝子の同定における最も重要な段階は、その単離である。DNAは、任意のタイプの組織および細胞含有核から単離することができる。DNA単離の手順は、エタノール中で沈殿によって細胞小器官、膜の断片を除去し、タンパク質の酵素的破壊とフェノールおよびクロロホルム溶液からの抽出、DNA濃度の遠心分離により細胞の迅速な溶解を含みます。

遺伝子検査室では、DNAは最も頻繁に血液白血球から単離され、患者は抗凝固剤（ヘパリン）を含む滅菌チューブ内で5〜20mlの静脈血で採取される。次いで、白血球を分離し、上記の工程に従って処理する。

研究への材料の調製の次の段階 - 制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素） - 厳密に特定の塩基配列を有する部位での断片へのDNA「カット」は、細菌酵素によって行われます。制限酵素は、二本鎖DNA分子に4-6の特定の配列、少なくとも8〜12個のヌクレオチドを認識し、そのこれらの配列の断片に分け制限部位と呼ばれるサイトをローカライズします。産生される制限DNAフラグメントの数は、制限部位の頻度によって決定され、フラグメントのサイズは、元のDNA分子の長さに沿ったこれらの部位の分布によって決定される。制限部位がより頻繁に位置するほど、制限後のDNAフラグメントはより短くなる。現在、細菌起源の500種類以上の異なるタイプの制限酵素が知られており、これらの酵素のそれぞれは、その特定のヌクレオチド配列を認識する。将来、DNAの遺伝マーカーとして制限酵素サイトを使用することができます。制限の結果として形成されたDNA断片は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって長さに沿って配列することができ、したがってその分子量を決定することができる。通常、特定の染色（より頻繁に臭化エチジウム）がゲル中のDNAを検出するために使用され、ゲルはスペクトルの紫外領域の透過光で観察される。DNAローカライゼーションの位置は赤色である。しかし、いくつかのDNA制限の処理で人が、彼らは、電気泳動によって分離することができないことは、異なる長さの非常に多くのフラグメントが形成エンドヌクレアーゼ、視覚的（ゲルの全長にわたって生成均一な着色）を電気泳動するために、個々のDNA断片を同定することは不可能です。したがって、標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法を用いて、そのようなゲル中の所望のDNA断片を同定する。

DNAまたはRNAの任意の一本鎖セグメントはその相補鎖に結合（ハイブリダイズ）することができ、グアニンは常にシトシン、アデニンとチミンを伴う。これは二本鎖分子の形成である。クローン化された遺伝子の一本鎖コピーが放射性標識で標識されている場合、プローブが得られる。プローブは、DNAの相補的なセグメントを見つけることができ、その後、ラジオオートグラフィーによって容易に同定される。伸長した染色体の薬物に添加された放射性プローブは、遺伝子が特定の染色体上に局在することを可能にする。特定のDNA試料は、サザンブロッティングにおいてDNAプローブで同定することができる。ハイブリダイゼーションは、DNAの試験部分が正常な遺伝子を含む場合に起こる。異常なヌクレオチド配列が存在する場合、すなわち対応する染色体構造が変異遺伝子を含む場合、ハイブリダイゼーションは起こらず、病的遺伝子の局在を決定することができる。

DNAプローブを得るために、遺伝子クローニング法を用いる。この方法の本質は、DNA断片が細菌クローニング粒子、通常は細菌プラスミドに挿入された遺伝子の任意の遺伝子又は領域に相当する（細菌細胞における円形の染色体外DNAの存在及び抗生物質に対する耐性遺伝子を有する）、及びその中に構成されてい組み込みのヒト遺伝子を有するプラスミドを有するプラスミドを増殖させる。プラスミドの合成プロセスのおかげで、ヒト遺伝子またはその部位の数十億コピーを得ることが可能である。

さらに、放射性標識または蛍光色素で標識されたDNAコピーを、調査されたDNA分子プールの中の相補的配列を探索するためのプローブとして使用する。

現在、遺伝子突然変異の診断のためにDNAプローブを使用する方法には多くの種類がある。

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