胚性幹細胞

胚性幹細胞の発見は - そこには偶然ではなかった、と発生生物学研究の分野で製造した土壌の調査に登場しました。用語「幹細胞」は、ベルリンの血液議会の協会で1908年に医学に導入されたアレクサンダーMaximovは造血細胞に適用されます。研究プロセスの早期開発中の分離および多能性胚性幹細胞の安定株の調製は、幹terato-（胚性癌細胞がどのと初期遺伝子と自分の仕事のタンパク質産物の発現の配列を含む、胚発生の未知のメカニズムを研究に使用する前に長いです。

しかし、ヒトゲノムの全能性は進化の過程で回復不能に失われていますか？いいえ、胚形成は証明です。そうであれば、原則として、進化発展の第二の道が実現されるのだろうか？おそらく、人間が宇宙を離れるとき、環境条件はかなり長い間、比較的一定であろう。骨量の減少（無重力状態で骨の脱灰）非常にゆっくりと従順再構築および再生が空間に存在の種としてのヒト適応プロセスの最初のステップとして考えることができます。しかし、進化発展の第2の経路の支払いは異なります。無菌性は、全能性と完全可塑性のすべての細胞に返済する価格になります。"進化のカメレオン"のこの世界で繁殖は減数分裂、otpochkovaniemを持たないでしょう。しかし、私たちは長く生きるでしょう。テロメラーゼ不死は、アメーバの不滅性です。多細胞生物において、幹細胞は定量的および定性的な寿命の基質である。

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胚性幹細胞の源

今日の臨床検査のための胚性幹細胞の供給源は、ラインネズミ奇形癌（129 / SV、F19、F8、ツィン40、CGR 86は、R、CCE、JM-1、E14TG2a、CGRSb）およびヒト奇形癌（NTERA-2、TERA-2であります、H-9クローン）、ならびにヘスTrauneona。しかし、免疫表現型を示す詳細なセルラパスポート、受容体およびタンパク質の細胞内シグナル伝達を露出mRNA発現プロファイルの染色体分析の結果は重大な欠点teratokartsinomnyh線ESCを補償しない存在は - 培養物中の臨床試験における全能性とアプリケーションの不可能の急速な喪失、および混合分化は、単離することは非常に困難です細胞の異種集団からの純粋な特殊線。このため、通常臨床目的のために製造ソースESC株は、胚盤胞の内部細胞塊としての、胚発達の8細胞期の個々の割球、細胞が後期桑実胚を、一次胚細胞。

奇形癌細胞は多能性の性質を有するが、ESCと比較して多能性潜在性がはるかに低いことが特徴であることに留意すべきである。それらの胚細胞との統合は、奇形細胞の遺伝子型を有する配偶子が決して形成されないキメラの形成をめったにもたらさない。これは、テラトカルキン細胞の培養における染色体異常の出現が頻繁に起こることによるものと考えられている：Y染色体の喪失、種々のトリソミー、欠失、または転座。

ヒトESC系統を区別しようとする試みは何度も行われてきたが、正常なヒト胚盤胞は物体にアクセスすることが困難であるため、この課題は解決できなかった。さらに、ヒトにおいて、染色体異常の頻度は動物の胚発生よりも高い。インビトロ受精後に得られる初期のヒト胚の大部分は、カオス染色体モザイクを示し、しばしば数値的および構造的異常がある。後でさえ、胚盤胞段階では、ヒト胚の20〜25％のみが正常な核型を有する細胞からなる。接合子は通常2つまたは4つの割球の段階まで培養され、次いで子宮に移植されたので、ESCを作製するためにそのような胚を使用することはほとんど不可能であった。比較的最近になって、胚盤胞期に受精したヒト胚珠を培養するために開発された信頼できる技術しかなかった。この技法を体外受精の実践に導入することは、成功した移植結果の頻度を増加させるだけでなく、正常な胚盤胞をより接近可能な対象にした。

別の多能性幹細胞の供給源は、より高度な前駆細胞集団germenativnogo上皮とは対照的に、ベータインテグリンの表面にされていない、一次性細胞であるが、高活性shelochnoyホスファターゼを発現します。始原生殖細胞から形成されている幹細胞の集団の実験では前世紀の80居住で研究されていることに留意すべきです。同時に、初代生殖細胞をマウス胚生殖腺の基幹から単離する技術が開発された。細胞は、しかし生き残ったが、増殖していないと、最初の日以内に死亡したとして、in vitroで始原生殖細胞を培養の最初の失敗の結果は、これらの取り組みの無益さを示唆しています。後でそれは、初代マウス生殖細胞は、可溶性および膜結合型特異的ポリペプチド成長因子の培地中のみの存在下でインビトロで増殖することが見出されました。多くの研究は、培養培地中の存在のみならず、LIFが、始原生殖細胞の生存および増殖のためmembrannosvyazannyhとスチール可溶性因子（SIF）が必要であることが示されています。これらのペプチドは、鋼の突然変異のためのホモ接合体細胞胚によって生成され、そのうちの一つは、癌原遺伝子CKITのリガンドであるされています。

哺乳類およびヒトの初代生殖細胞は、性腺外起源のものであり、性細胞株のクローン発生の源である。ライン始原生殖細胞、ならびに胚および胚体外中胚葉の全ての組織を開始するエピブラスト（主外胚葉）モザイク構造組織を持つ初期胚を提供します。初期胚の様々な部分の顕微外科的除去は、初代生殖細胞のコミットされた前駆体のクローンの胚盤葉に局在化ゾーンを確立した。細胞マーカーとして使用したrodamindekstranaとその前駆体始原生殖細胞は、胚体外外胚葉の近くに、胚盤葉上層の近位領域に位置していることを見出しました。初代性細胞株は、45細胞クローンから出現し、その配分は、原腸形成の始めに起こる。次に、クローン分離が起こり、原形成型の間に、初代性細胞は胚体外中胚葉に入り、一次バンドの後ろにある白子芽の基部に見出される。そこから初代生殖細胞が子宮頸部内胚葉の腹側に移動し、次に腸間膜に沿って能動的に移動し、移動の終わりに生殖器ローラーに移入する。移動過程では、生殖腺の基部における局在の最初の2〜3日と同様に、初代性細胞は活発に増殖し、8回の複製サイクルを経る。移動の開始時に約50の初代生殖細胞が存在する場合、12日間の発育のマウス胚の生殖嚢胞において、初代性細胞の数は25,000を超える。

ESCと始原生殖細胞の機能的類似性は、置換胚盤胞の内部細胞塊および胚のその後の完全な発展、唯一の子孫始原生殖細胞から成る組織における後者の完全な統合を示しています。他の特徴によれば、マウスの一次胚細胞のPGCは、異なる方向に分化するためにインビトロで胚様体を形成する能力を示し、また同じであった、ライン129 / TERを自発的奇形腫精巣マウスに似た免疫不全マウスに皮下注射インビボフォーム奇形腫。

LIF培地に添加すると、その確立された、可溶性membrannosvyazannogo SIFは、8日のマウス胚の一次胚細胞が生存し、4日間培養して増殖するが、その後、ダイを単離します。また、死の培養は、始原生殖細胞が観察された期間は、マウス胚（12.5~13.5日）の発達の段階、芽原発性腺雌性の生殖細胞が減数分裂を入力し、雄始原生殖細胞でブロックされている有糸分裂と一致します部門。しかし、あなたが環境に追加した場合だけでなく、成長がLIFおよびSIFの因子が、また、FGF2の、主要な生殖細胞はproliferirovatを継続し、サブカルチャーは、細胞コロニーも成長因子（SIFとFGF）の環境から取り出された後に再現することができます形成されています。このような細胞は、可溶性増殖因子LIFを添加することなく、胚線維芽細胞基質上で長時間培養することができる。初代生殖細胞由来のこれらの安定な細胞系は、胚性生殖細胞と呼ばれることが示唆されている。この用語は、培養EG細胞は卵形成や精子形成のその後の段階を行うことができる胚性生殖細胞を得ることができない場合のように成功したと見なされることができません。これは、しかし、胚性多能性幹細胞の性質を獲得する文化では、始原生殖細胞に由来するが、EG-細胞株は、germenativnyeラインをコミットする能力を失うという事実によるものです。言い換えれば、培養中の主要な生殖細胞は、前駆体とESCのような多能性細胞に形質転換し、そのプロパティの配偶子を失います。

免疫不全EGマウスを投与する場合、奇形腫は生じないことに留意されたい。ヒトEG細胞が奇形腫を発症する能力の喪失は、これらの系統が培養初代生殖細胞から直接的には作られず、胚様体から単離された細胞から得られたという事実によると考えられる。したがって、それらは多能性であるが既にコミットされた細胞の子孫である可能性があります。

EG細胞と初代生殖細胞との間には基本的な違いがあることに留意すべきである。後者は、一次生殖細胞が内部細胞塊または栄養外胚葉に組み込まれる能力の欠如を示す、キメラマウス胚を得ることを可能にしない。後コミット行のほとんどの体細胞胚に類似人口特性始原生殖細胞、胚盤胞への導入は、キメラ胚の形成をもたらします。

多能性細胞の別の集団を受信するために選択培地上での選択によって許容される細胞のEG-凝集で得られた胚様体を培養修飾技術は、胚様体（ - EBD細胞胚様体由来細胞）に由来する「細胞と呼ばれます。長時間培養液中で増殖する細胞のEBD-能力は、安定な細胞株コミットした細胞を作成することが可能となりました。広範囲のmRNAを発現する細胞のクローンおよび特殊細胞のタンパク質マーカーが得られた。ニューロン、グリア、血管内皮、造血細胞、筋肉、および内胚葉細胞：結果として、このアプローチは、主セックスヒト多能性細胞は、様々な細胞型にインビトロで分化することを証明しました。

胚性幹細胞の代替供給源

ヒトESC株の代替供給源は、ハイブリッド細胞であり得る。以前に前核から削除されていた卵牛とヒト体細胞、fetusaエレクトロポマージするときに得られた偽妊娠牛geterogenomnoy構造の子宮への移植は、着床前胚人工発達段階の内部細胞塊を受信することが可能となります。この目的のために、第一段階で移植されたヒト細胞の核を有する胚盤胞卵牛から得られます。

第2段階では、胚盤胞を胚盤胞から抽出し、胚盤胞をThomson法に従ってESCから抽出する。この方法による分離ESC株における最良の結果がハイバネーション状態で人体に持続濾胞細胞または始原生殖細胞のコアを用いて得られたことは注目に値します。これは、牛の卵移植されたヒト細胞核neukorochennyeは、ハイブリッド卵（レーピン、2001）に由来する早期老化ESCクローンを回避し、高活性とテロメアtelomeazyを持つべきであるという事実によるものです。最も重要な細胞内マーカータンパク質の始原生殖細胞は、タンパク質をクロマチン、いわゆるサイレンサーに属しているのOct3、Oct4の、のTcf、グルーチョ、であることが知られています。サイレンサーは、ユークロマチンのループの形成を防止するヘテロクロマチンの特にコンパクトな包装を提供する。これらのタンパク質によって媒介されるクロマチンパッケージは、ESCゲノムの全能性と相関する。今日まで、牛およびヒトの成熟胚珠は細胞質中に高濃度のサイレンサータンパク質を含む唯一の特殊細胞であることが確立されている。これに基づいて、体細胞核を牛の非核卵子に移すことによってハイブリッドESCを生成する方法が開発された。予備のin vitroの研究では、卵母細胞の牛の細胞質は、文化の12〜24時間後にヒト体細胞核の全能性ゲノムを復元することが示されました。

特に興味深いのは、マウスよりも多能性細胞の集団による全能性細胞の後の置換を示す、ヒト胚の着床前発育の特徴に関するデータである。細胞形質転換の研究は、ESCに加えて、ヒト胚盤胞の内部細胞塊の細胞も栄養膜細胞を生成することを示し、これはそれらの総効力を示す。

胚盤胞の段階では、異なる2つの異なる細胞集団が存在することが知られている。それらの1つは、栄養膜細胞および他の胎盤胎盤成分に由来する胚盤胞、外胚葉の外層である。第2の細胞集団は、栄養外胚葉の内面に接触する高密度塊にグループ分けされる。内部細胞塊の細胞集団は、胚器官のすべての組織および細菌に由来する。後期胚盤胞の段階で、余分な胚内胚葉が内部細胞塊から形成され、外胚葉が形成される（原発性外胚葉）。同時に、胚盤葉細胞は多能性を保持するが、胚芽外胚葉の細胞を分化させる能力は限られている。

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ヒト胚性幹細胞の取得

最近まで、それは栄養膜は不可能ヒトES細胞から得られたものと考えられていました。代わりに、LIFおよびFGF2ヘパリン含有培地中で胚盤胞から単離されたが、二倍体ライン栄養外胚葉幹細胞は、増殖した幹細胞に形質転換します。あなたはFGF2の中から削除した場合は、栄養外胚葉細胞は、それらが徐々に巨大な栄養膜細胞に形質転換trofektodermalnye染色体と細胞要素の核内倍加を開始し、繁殖を止めます。おそらく、LIFは、細胞質受容体（FGFR2）に結合する、FGF2はFGF2としてメカニズムtranssignalizatsiiをトリガするという事実に起因栄養外胚葉細胞の増殖を刺激しない、細胞質内にMAPキナーゼを活性化 - ERK1およびERK2を。したがって、一つのシグナリング経路の胚盤胞の細胞に取り込まれたときに（LIF - のgp130 - JAKキナーゼ - STAT3）膜貫通シグナルの第二の機構を活性化しながら、内部細胞塊細胞は、多能性ヒトES細胞に形質転換される（FGF2は - FGFR2 - MAPは、キナーゼERK1 / ERK2）形成された胚盤胞の栄養外胚葉における幹細胞。シグナル伝達経路の選択は、順番に、遺伝子OCT4の活性に依存します。この遺伝子は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞において、および始原生殖細胞期間を破砕並びににおいて、軌跡T 17常染色体に位置し、卵形成の間に発現され、POUドメインに属します。機能的役割のOCT4遺伝子が多能性細胞の発生、分化および脱分化に必要な転写因子をコードしています。

ESCにおけるoct4遺伝子の発現は、この転写因子と補因子との相互作用によって異なる。胚盤胞におけるoct4発現の方向制御は、その活性が低下すると細胞の半分が栄養外胚葉を形成し、一方、oct4の誘導発現が増加すると主にESCが生じることを示した。

実験では、破砕の段階での全能割球を培養するとき、ならびに生殖段階および胚発生の後期段階で、ESCを系統に変換することはできない。正常胚 - マウスのESCは、通常、第（胚盤胞の単層）及び第七段階（初期卵筒胚盤胞の二層）に相当する3.5~4.5日妊娠、に割り当てます。明らかに、着床前の期間においてのみ、マウスの胚はESCに変換することができる細胞集団を含む。その結果、ESC系統の単離は、胚発生の特定の段階でのみ可能である。全能性は、胚性膜および胎盤からの生きた胚の開発のための機会の面で接合体であり、破砕割球の間に生じます。胚芽細胞の全効力の喪失は、後期胚盤葉破砕がそれらの位置に依存する後期桑実胚段階で始まる。初期のモラブロマイシンは全能性を保持する。なぜなら、それらの位置の変化を伴う実験的操作、例えば、それらの位置の逆転は完全な胚の発生を妨げないからである。

系統内のESC放出の効率は、胚盤胞期の状態に影響されることが判明した。妊娠3.5日で卵巣を摘出し、プロゲステロンで処置したマウスの生殖管、休眠の7日間のシミュレーション後の胚盤胞の使用は、胚性幹細胞のラインのさらなる成功の分離に貢献しています。そのような条件下で、内部細胞塊を形成する割球の数が増加すると考えられる。細胞周期が伸長し、ほとんどの割球がG0期に入る可能性もある。

また、安定した多能性hESC株の作成が遺伝子型胚に依存：ESCをマウス胚盤胞ライン129から極めて容易に識別、hESCを胚盤胞CBA /カルシウムマウスからのラインを分離するために、マウスCS7BL / 6と事実上不可能を使用して得ることが著しく困難です。明らかに、初期胚は、多能性ESC系統の発達に影響を与えるいくつかの遺伝的特徴を有する。しかし、培養胚盤葉上層を絶縁するとき、ならびに初期胚からのhESC細胞株を分化選択的に選択することによってCBA /カルシウムマウスがまだ割り当てられていました。

胚盤胞からESK系統を得るための実績のある標準的な技術は、初期胚の実験技術に関する実験マニュアルに記載されている。実験的ESK系は、4.5日齢のマウス胚の単離された胚盤葉（一次外胚葉）をかなり複雑な顕微手術技術および改変された培養条件で培養することによっても得ることができる。ESC系統の形成頻度は、胚盤胞の内部細胞塊を用いた作業よりもはるかに高かったので、この手順の複雑さは正当である。

各クローンを単離するためのESC株は細胞のマイクロウェル、栽培40-60凝集に移し、それを再び分散されます。この手順を複数回繰り返しは、全能性と高いテロメラーゼ活性を保持する貫通路50-100プラスチックに付着最大増殖速度normokariotipnyh細胞と不死化ESK線を得ることができます。支持ラインの処理で最大の危険は、汚染又は血清細菌内毒素であるESC - でも培地中のエンドトキシン濃度のトレースが未熟生殖細胞の大量死を引き起こしました。培養中の線形成長とESCのタイムリーな分散の注意深い制御との両方の娘細胞は、二倍体核型および総効力を維持し、多能性と細胞周期を無制限に行うことができる残っている、対称分裂することが可能です。

ヒトESCのクリーンな集団の選択は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の合成をコードする遺伝子を含む組換えDNA分子のゲノムへのトランスフェクションの後に行うことができる。分化の開始とともに、選択的培地上で純粋で安定した多能性細胞株の選択を可能にするこの遺伝子の発現レベルが低下する一方、GFP発現は、その増殖を支持する条件下でESCの増殖とともに増加する。GFPをESCで選択して培養すると、選択作物の条件において、分化細胞の強力な抗増殖効果がなくなるため、コロニーの頻度が大幅に増加する。

体外受精手順の後に残る着床前胚（ステップ80-120細胞）の単離のそれらの方法によって行におけるヒト胚性幹細胞の翻訳。機械的に、中Delbekko針に分散させ、この合成により産生さ「過剰」胚をすることができません。単離された細胞embryoblastモノクローナル抗体の選択的蛍光標識を用いて細胞を標識した後。Embryoblastはコラゲナーゼディスパーゼの混合物を用いて単一細胞に分散させました。解離した細胞は、3つの第一通路をフィーダ胚性線維芽細胞の単層上（IL-6、LIFおよびSCFの500マイクログラム/ mlの存在下での80％Delbekko培地+ 20％ウシ胎児血清）特別な培地中で増殖させました。したがって幹細胞および前駆細胞の生存および増殖は、IL-6、LIFおよびSCFへの暴露によって維持されます。この環境では、サスペンションのhESCが付着していない細胞osharennyhクローンは穏やか複数のピペッティングにより解離されるように成長します。5日〜7日に中断した文化に新しいクローンが出現します。ESCの最大増殖速度は、10〜15個の細胞の段階でのクローンの反復解離によって達成される。次いで、各クローンは、マイクロセルに移し、40〜50個の細胞の凝集体まで成長させました。手順は6 cmディッシュあたり5から10000000個の細胞の密度に培養物の容積を増加させる、通路に多数回繰り返されます。使用してこのようなトムソンは、それが誘導された350社の特殊な細胞株のいずれかに分化と、通路100を介して高テロメラーゼ活性、強い増殖および表現型の特徴最小合計効力する能力を保持する不死化ヒトESCを10個のクローンを単離し、継代エクト、メソ - および内胚葉。ヒトESCの分化は、接着受容体の細胞骨格および発現の発達を示し、基板への細胞付着を有する（培地、添加および血清LIFの除去の変化で）開始しました。ヒトESCの無制限の増殖が正常な核型を維持することが重要です。

ヒトESC系統を単離する第2の方法は、初代性細胞の使用に基づいている。実験的研究により、12.5日齢のマウス胚の生殖器斑からEu細胞株を得ることができることが示されている。しかしながら、これらの場合、前駆細胞株の形成の頻度は、以前の胚を用いた実験よりも有意に低かった。同時に、13.5日の妊娠期間のマウス胚の生殖腺からの初代性細胞は、一般に線に変換することができない。

ヒト多能性EG細胞の最初の安定株は、生殖器の原基5-9週齢の胚から単離された初代gonocytesに由来するものでした。単離された細胞は、胎仔血清を含むDMEM培地中で不活性化されたマウス胚線維芽細胞の基質上で培養されたメルカプトエタノール、フォルスコリン、ならびに組換えヒト成長因子（FGF及びLIF）を添加しました。7〜12日後、ヒトEG細胞に対応する形態学的特徴および分子マーカーに従って、多細胞コロニーが培養液に出現した。凝集後、これらの細胞は胚様体を形成し、3つ全ての胚葉の派生物に特徴的な特殊細胞が現れた。10〜20継代にわたって、EG細胞株は正常な核型を保持し、多能性を失わなかった。

また、LIF、膜結合型および可溶性Steel因子ならびにTGF-bの併用効果は、初代生殖細胞の発生のためのプログラムを変更することも示されている。有糸分裂の分裂を止め、卵形成または精子形成に分化し始める代わりに、初代性細胞は増殖し続ける。いくつかのさらなる有糸分裂サイクルの後、それらは、胚盤葉細胞と同様になり、生殖細胞の前駆体の性質を失って、多能性胚性幹EG細胞に形質転換される。

したがって、1998年に、初代性細胞の不死化株が、ヒト胎児剖検組織の性的基盤から最初に単離された。ヒト初代生殖細胞の胚は、開発の第3週で卵黄嚢に表示され、4-5th週間に、これらの細胞は、それらが主dormantnyeのgonocytesの集団を形成性的結節の面積、中に移行します。不活性状態では、初代生殖細胞は誕生まで芽に残る。一次胚細胞株は、定量的および定性的な増加細胞収率コラゲナーゼタイプIV-V、ヒアルロニダーゼおよびDNアーゼの混合物で処理された即席ファブリック取得胎児性器結節5-9週齢の胚から抽出しました。胎生生殖結節の組織における一次生殖細胞は、セルトリ間質（間葉系）細胞に取り囲まれている。セルトリ細胞の機能的な目的は、抗アポトーシス因子（Fasリガンド）、マイトジェン、および身体による免疫攻撃から性的幹細胞を保護する免疫抑制剤の製造です。さらに、生殖器結節の間質微小環境は、生殖体の成熟において重要な役割を果たす。単離された初代生殖細胞は、最初の3つの継代の胎児線維芽細胞からなるフィーダー間質層上の培養物中に植え付けられる。マイトジェンの最も有効な組み合わせは、LIF、FGFおよびフォルスコリン（cAMPの形成のための刺激剤）からなる複合体である。in vitroでの増殖始原生殖細胞は、基板に球状、非接着細胞の形成を伴う培養クローンにおける主要再生gonocytesの存在下で、胎児血清の添加を必要とします。

科学の進歩と今後の研究の方向性：胚盤胞に由来するヒトESCラインの配分の方法に関する既存の情報を要約に基づいて米国国立衛生研究所は、ESCの成功配分がうまく形成された内部細胞塊を用いて培養した胚盤胞は、（幹細胞場合に最も可能性が高い予備的な結論を作りましたNat。Inst、of Health USA）。この観点から、ラインを作成するためのESCの最良のソースは、内部細胞塊の割り当ては慎重に栄養外胚葉を削除する必要がありますそれらの開発の人間の胚盤胞5日目、です。30-35細胞のこの段階で成る単離された内部細胞塊を培養ヒトES細胞におけるコロニー形成のための決定的な条件である基板マウス胚性線維芽細胞上で培養されなければなりません。

胚性幹細胞の表現型特徴の分析

特に興味深いのは、ESCの表現型特徴の種間比較分析である。扁平な上皮細胞の密なクラスター、マウス胚子牛が丸みを帯びた細胞の緩いコングロマリットで構成されている間 - それは人間のESCコロニーがあることが判明しました。ヒトESCでは、核プラズマ比の指標はマウスESKよりも低い。サルの胚性幹細胞は、不均一な縁を有するより平らな細胞コロニーを形成する。ESC霊長類の初期のクローンでは、単一の細胞が容易に見られる。ヒトES細胞を増殖性動物のすべての種は、MHCクラスIおよびIIを発現しません。同時に、ヒトESCは、その表面のケラチン/コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、胚（奇形腫）の特性-kartsinomnyh幹細胞上の存在を示す抗体TERA 1-60及びGCTM-2に対する陽性応答を与えます。ヒトES細胞での発現は、動物のOCT4遺伝子のすべての種類は、ヒトおよびマウスのESCにおける表現型の違いにもかかわらず、明らかに多能性（ペルー、2001）を維持する責任遺伝子の同じセットによって活性化され、ことを示唆しています。また、胚性ラット、ブタ、ウサギ、霊長類、および牛由来ESCラインは、同様の形態学的特徴を持っている、あなたは異種移植の問題で新鮮な表情を取ることを可能にする胚発生プログラムの実施のためのマーカーの分子同定とほぼ同一の分子メカニズムの同様のセット。

インビボでの正常胚とは異なり、ヒトES細胞のインビトロ増殖が胚層の形成を伴わないと器官ことなく、すなわちホメオNohgenovの背景を、ブロックに進みます。セグメンテーション遺伝子は、タブ体節核のセグメンテーション、卵黄嚢の形成、尿膜provisoryおよび他の器官および組織のような期間の胚形成を再現することは不可能で培養ヒトES細胞では機能しないからです。培養ESCは、特殊細胞の350本の制限株の形成の初期に凍結された。したがって、クローン子会社前駆細胞と中央局在のPGCは、共通の前駆体からしかしながらのみモデルの異なる組織領域を一の段階で形成されている開発中の胚由来の特殊化した細胞とは異なるが、あります。培養及び凝集体にスラリーhESCを胚盤胞またはさらに後の胚（卵シリンダ）に似た構造を形成する：hESCの表面上の受容体の最小レベルが、それらは原始形態形成初期胚の構造の大部分をシミュレートするプロセスを実行する能力を保持します。そのような懸濁凝集体は、単純かつ複雑な胚様体と適宜称された。

混合されたときに同時に初期遺伝子外胚葉（OCT3、FGF-5、節）、内胚葉（GATA-4）、中胚葉（ブラキュリ）、心原性中胚葉（PKH-2,5）、神経管（msx3で表さ胚様体の様々な細胞に分化）および造血（elkf）。原腸形成および初期の器官形成期のモデル化への道を開き、好ましくは遺伝子外胚葉または中胚葉に発現させたが、胚様体を得ることができたケースの数、in vitroで胚葉細胞の形成を標的化するためのサイトカインおよび成長因子の種々の組み合わせを使用して。

他の娘細胞は、前駆細胞の生成を生じるながらhESCのクローン増殖は、中心クローンにおけるESCの一方のみが非限定的な再生能力を保持する、非対称細胞分裂の証拠であり、分化は既に来ています。したがって、胚様体の周辺におけるクローンの増殖率は、中央よりも高い。成長クローンの周辺細胞は、自発的な無秩序な分化を受け、アポトーシスの機序によって遊走または死滅する。これらのプロセスの逆比 - 増殖率は、遊走およびアポトーシス細胞死の割合を超えた場合、これらのイベントは、クローンの運命を決定し、クローンのサイズが増加し続け、安定化は等しいアポトーシスおよび新しいセル速度、回帰の形成速度で起こります。前駆細胞は対称的に分裂する、すなわち、両方の娘細胞は成熟した特殊化細胞株にさらに分化する。ESC /前駆細胞の比率は様々であるが、常にESCの量は前駆細胞集団のわずか1％に過ぎない。したがって、注意深いピペッティングとタイムリーなクローンの分離のみが、培養中のESCの数を増加させる可能性があります。ESCの最大収量を得るためには、最も効果的なのは、10〜12個の細胞の段階でクローンの解離であった。胚様体における細胞の方向および分化の程度は、それらの位置に依存する。外装胚様体細胞は、遺伝子およびOct4を発現しない続い類上皮細胞を形成し、胚体外臓側内胚葉を頭頂そこから一次胚葉細胞に分化を受けます。胚様体の内部細胞はoct4遺伝子を発現し、48時間培養すると多分化能を保持する。しかしながら、培養の形態学的再編成が上皮単層において起こり、そして一次外胚葉の発達を制御する遺伝子の発現が始まる。その後、3つの胚芽シートのすべての派生物である様々な細胞型の出現を伴う完全な無秩序な細胞分化のプロセスを開始する。胚様体の細胞の自発的分化の過程において、卵黄嚢の断片（嚢胞）の形態の内胚葉マーカーを有する凝集体が最初に現れる。さらに、増殖する毛細血管の血管芽細胞および内皮細胞がこれらの構造に現れる。胚様体の内部の細胞の自発的分化の最終段階では、ニューロン、グリア要素、心筋細胞、マクロファージ及び赤血球を含む種々の分化細胞を、開発しています。特定の近似（胚組織を形成するシートの空間反転を考慮して）インビトロでの胚様体を介して形態形成のプロセスを探索し、胚細胞分化初期の分子メカニズムを分析し、これらのプロセスの実装における特定の遺伝子の役割を確立することができます。

したがって、クローン内には、ESC、初期前駆細胞および分化前駆細胞集団など、異なる遺伝的発生プログラムが発見された細胞がある。フィーダー層を持たず、LIFを培地に添加しないで垂下する滴または質量培養の方法によるESCの培養は必然的に胚様体の形成を導く。胚様体の外層および内層の細胞の形態は異なる。外側の層は、大きなプロセスセルからなる。環境に面するそれらの表面は、多数の微絨毛で覆われている。細胞の外層は、Reichert膜に似ている内部基底膜から分離され、胚様体の内層の細胞は円筒状の上皮である。形態学的には、内層は、多くの分裂細胞を含むが、未分化ESCコロニーをより彷彿とさせる。

ヒト胚性幹細胞の特徴

このタブが形成インフラprovisory器官が破壊されているので、培養物中のPGCの無秩序な増殖を引き起こすホメオシス遺伝子を遮断背景信号に実質 - 間葉相互作用の不在。未組織の成長と、今後の体の間質枠組みをマーキング間葉の欠如への文化の中でhESCの無秩序な自発的分化：in vitroで、それは肝細胞の数百万人の形成が可能であるが、あなたは、このような副鼻腔、Disseとクッパー細胞のスペースなどの構造的および機能的要素を含む、肝臓の任意のセグメントを取得することはできません。

ESCの多能性は、臍帯と胎盤は栄養膜を得ている一方で、胚の組織や器官を形成するために、胚発生に独占的に実現すると考えられています。ESKが一貫細胞クローンを生成trofektodermalnuyuシェルで囲まれた空間的配置、形状、寸法、構造的および機能的単位で仮と決定的な臓器の細胞と実質アセンブリの数を予め組み合わせたmRNAバルクNohteyaov地形行列、によって開発プログラムを実現provisory。同時に、ESCは、彼らのポテンシャルの実現の分子メカニズムは完全に自身が受容体認識とtranssignalizatsiiシステムの両方の閉塞に起因する他の細胞との相互作用の可能性を奪わ開発やESCO事業者の遺伝的プログラムから解離するのみ細胞型です。しかし、出産を終える段階的な展開の胚発生プログラムで十分な活性化のESCの結果が完全に形成され、細胞の十億で構成される生物の子宮外生活への準備ができています。この短い時間ではなく、細胞の重要な機能を提供する分子機構であり、それらの増殖、分化および特殊化を制御するプログラムのエラーの細胞空間経路必然的発生で想像を絶する債務。したがって、現代の薬理ゲノミクスで別々疾患分子デバイス、および疾患細胞のプログラミングを検討しました。そして、分化、増殖および器官のプログラムだけでなく、臓器や組織の再生の名前を矯正を目的とした新薬の大多数のアクション。ESCを経て成体生物では、行列を保存分化と専門ドナー間葉系細胞による損傷を受けた受信者の実質臓器を修復する脳、肝臓、脾臓、骨髄、人間の他の臓器に移植された幹/前駆細胞の挙動を制御することが可能となります。基本的に、全能性プログラムは、他の卵母細胞のゲノムレベルで、受精卵と割球を立ち上げているが、これらの細胞はexperientalと実用的な医療の必要性のために必要な量のクローンを作成し、継代することはまだ不可能です。したがって、ESCは、原腸形成中の特殊な細胞株の胚とコードの三次元線形制限マップを含む遺伝情報のユニークな源です。

それらのゲノムは、分化した体細胞の遺伝的装置とは対照的に、多能性を維持しているという事実に、回生ESCの事実上無限の可能性。受容体の限られた数を表現するのESCの表面には、したがって、その微小環境と細胞の核装置をtranssignalizatsii対話する非常にいくつかのプログラムを展開 - ESCの遺伝情報に根ざした休眠状態の一つの症状は、いわゆる最小表現型です。特殊な細胞株および細胞の分化の制限の原因でハイバネーション遺伝子を背景に、わずか約30その製品周囲の微小環境との通信セルを提供する500個の遺伝子を活性化します。最後決定極めて低い受容体のmRNAの量、Gタンパク質、セカンドメッセンジャー、転写酵素で体細胞とESCのエネルギー代謝を調節する主要な機能ゲノムボックスの一般性は、発現および抑制を補因子ことを示しSAGE法の方法を使用してすなわち、細胞への調節シグナルの膜貫通トランスフェクションの系全体である。これは、トランスユニット化遺伝子の欠如または非常に低い発現に起因する。ESC 18の動作のゲノムに誘起分化の間に同期細胞接着受容体、細胞外マトリックス成分の合成を制御するバックグラウンド活性化transsignalizatsii 61遺伝子のための遺伝子を機能停止させる、制限は、血漿細胞膜受容体と核ユニットのmessendzhernyh要素および信号伝送システムを転写酵素。同時に、全能性ゲノムのヒトES細胞を提供するkoingibitorovタンパク質のサイレンサーの合成に関与する遺伝子の発現と同様に、遺伝子発現を遮断しました。

3つ全ての胚葉の細胞について遺伝的マーカーが見出された。遺伝子の発現節、OCT3およびFGF-5上に担持された識別外胚葉細胞層、中胚葉細胞 - 遺伝子ブラキュリ、ゼータグロビン、内胚葉 - GATA-4遺伝子発現における。正常胚では、原腸形成中に局所的に頭蓋顔面骨の領域、脳、末梢神経系、心臓伝導系およびクローン変位細胞から形成されている胸腺組織の一部を指定し、幹細胞および前駆細胞の未熟集団の能動移行を観察しました。細胞標識初期遺伝子の生殖層は、発生中の胚における前駆細胞の移動の地形分析のために、それが容易になります。なお、第1の遺伝子の中胚葉ブラキュリの凝集体のembryocarcinomaのP19発現の細胞は初期中胚葉遊走集団のマーカーである組織プラスミノーゲン活性化因子、α-フェトプロテイン、ケラチン8、ケラチン19、の遺伝子発現の減少の間に開始することが特に見出されます。これにより、中胚葉起源の組織の形成は、マイグレーション及び沈降点中胚葉前駆細胞の処理後に始まります。

非常に限られた表現型の特徴やブロックtranssignalizatsii ESCのほとんどの不在で、それにもかかわらず、それらを識別するために使用できるいくつかの受容体分子を発現します。抗原がヒトでESCのマーカーであり、霊長類が一般的であったことは注目に値します。ほとんどの場合、抗原に対する抗体を標識した標識ヒトES細胞のために使用されるSSEA-3、SSEA-4（シアル酸と複合糖GL7を表すユニークな脂質抗原）、ならびに高分子糖タンパク質TRA-1-81、TRA-1-60をmembrannosvyazannym。また、ヒトES細胞は、特異的胚抗原SSEA-1および内因性アルカリホスファターゼ、ならびに特異的な転写因子であるOct4を発現します。後者は、ヒトES細胞の増殖機構を維持するために必要とされる - 特異的転写因子Oct4の遺伝子は、線維芽細胞増殖因子4遺伝子発現の発現を活性化及び未熟細胞においてDNA畳語を非限定的に責任ボクシング安定します。最も重要な細胞内マーカータンパク質は、クロマチンサイレンサーのタンパク質に関連のOct3、Oct4の、のTcfとグルーチョ、です。

ほとんどすぐに、長期培養のESCの試行後に失敗し、生物が最初のマウス胚盤胞から単離された幹細胞の培養により調製し、プライマリ生殖細胞培養、胚発生の初期段階で投与した場合、ステージESCの多能性能力の研究を開始しました。これは、桑実胚および胚盤胞のPGCにおける全ての体組織でさえ配偶子において検出におけるドナーのPGC子孫キメラ胚を形成することができることが示されました。このように、発生生物学において有意プロセスブックマーク一次組織および器官、それらの分化および胚器官を研究する可能性を増加させ、インビボおよびインビトロでの実験的研究の間ESCスクリプト「ブリッジ」を使用。

よく胚形成の間、in vivoでESKは、初期胚の細胞塊に統合することが確立され、およびその誘導体は、すべての臓器や組織で発見されています。始原生殖細胞は、キメラ生殖細胞、完全な卵と精子を形成するの子孫の生殖系列にコロニーを形成します。胚性幹細胞はクローン原性である - 単一のPGCは、OCT4遺伝子の発現とアルカリ性ホスファターゼ、高いテロメラーゼ活性、ならびに特異的胚抗原の発現を含む分子マーカーを有する細胞のコロニーと遺伝的に同一で作成することができます。

層四割球をレシピエント及びドナーのPGCの外側に配置されている生物学的な構造を作成することによって、ヒトES細胞のキメラ化桑実胚の技術を用いて、胚発生のメカニズムを研究するために投与されます。したがって、栄養膜は、移植および胎盤形成を可能子孫四割球の受信者、および一次体および前駆配偶子の生存生殖細胞系から形成される内部細胞塊、として作用するドナーのPGCから形成されました。研究ESC値は実際にはいないだけという点で、それらのゲノムとのin vitroでの操作が多能性を保持したときに、またあるそのキメラ胚のヒトES細胞始原生殖細胞の形成に関与する能力を保持しながら。遺伝的に改変されたPGCの唯一の子孫は、すべての一次および8細胞胚での細胞の凝集または共培養によって得られた織物キメラ胚を形成する細菌コロニーを形成することが示されています。緑色蛍光タンパク質の遺伝子でトランスフェクトされたマウスのESC桑実胚に移植した場合、細胞の蛍光子孫は、発達中の胚（島田、1999）の全ての検討組織で見出されました。桑実胚におけるESCの移植が可能なマウスを作成することができ、本体は子孫が治療クローニングのさまざまなオプションのための機会を切り開くESCを、寄付したのみで構成されています。さて、このような方法論的なアプローチが正常に発生生物学の問題を研究するために適用されている、特に、それはX染色体またはヒトES細胞のエピジェネティックな不安定性の不活性化の遺伝的メカニズムを分析することができます。ESCの初期胚への移植は、遺伝子治療実験と同様に、農業におけるバイオテクノロジーにも使用されている。

遺伝的に改変されたESCの移植物は、変異遺伝子の標的細胞を試験するために使用される。インビトロ培養ESCは、ノックアウトマウスを作製するためにバイオテクノロジーで使用される。この目的のために、相同組換えにより、ESCの研究遺伝子（ノックアウト）から除去し、選択培地は、この遺伝子を欠く細胞を分泌します。次いで、ノックアウトESCを胚盤胞に注入するか、または桑実胚の割球と凝集させる。このようにして得られたキメラ初期胚をレシピエント雌と配偶子、この遺伝子のnullizigotnymiと個人間で選択された新生児マウスに移植されています。この技術によれば、実験生物学および実験医学において広く使用されている多くの系統のノックアウトマウスが作製される。これらの生物学的モデルでは、胚発生における特定の遺伝子の値だけでなく、疾患およびヒトにおける病態のメカニズムにおける役割を調べました。さらに、遺伝子治療の新しい方法の前臨床試験段階において、ノックアウト動物の系統が使用される。例えば、変異遺伝子のESK正常な対立遺伝子における遺伝子トランスフェクションを使用して効果的に突然変異を修正し、管理、造血系に入射します。ESCのへの外来遺伝子の導入が急速にラインホモ接合トランスジェニック実験動物を作成することができます。しかし、技術的組換え遺伝子の欠失が、確実に、まだ比較的ESCマウスを働いたことに留意すべきです。これらの遺伝子の欠失で - マウスのESCを使用して二重ノックアウトは、染色体7（コピーゲノム領域19分間ヒト染色体）上の遺伝子の機能的役割領域クラスタ、および第11染色体の近位部分（ヒト5D染色体コピー）をインストールしESKマウスはヒトにおけるそれらの類似体の機能を評価することができた。

胚の眼に - 実験動物は、特定の暗号におけるヒトES細胞は、タブの遺伝子の役割を明確に許可し、心原性中胚葉、PAX-6遺伝子を構成する遺伝子におけるヒト胚性遺伝子、トランスフェクションの容量機能研究。未熟増殖カードESC奇形癌における遺伝子の最初の式を構成し、胚盤胞のマウスは、ESKのtranssignalizatsii遺伝子で圧倒的な抑制を確認しました。通常の着床前マウス胚の変異ESCの組み合わせ60-80と20-30細胞は、私たちは原腸形成や器官形成における未知の遺伝子の役割を決定することができます体がドナーとレシピエント細胞から構成されているブックマークしたキメラ胚の発生につながります。骨格筋遺伝子ファミリーのGATA-1-4のタブで - - 腎臓タブのMyoDファミリー遺伝子で - 制限成熟における遺伝子の機能マップは、マウス胚に副腎や生殖器の原基における遺伝子SF-1タブの役割の拡大詳細、重量-1遺伝子を開発します赤血球形成およびリンパ球形成の原型。

ベクトルリコンビナーゼを使用してヒトES細胞における遺伝子の母方と父方の対立遺伝子のオフ監督は、初期胚と技術が深刻な遺伝性疾患の開発を担当し、新たな変異遺伝子の発見に貢献したマウスのESCにおける人間の未知の遺伝子のターゲティング中に様々な遺伝子の機能を解明するのに役立っ。梗塞のために、GATA-1 - - ブラキュリ骨格筋、 - - 中胚葉制限のためにHNF3及びHNF4転写酵素 - 造血組織のMyoDを赤血球するのGATA-4：使用してノックアウト方法は、胚組織を敷設するためのいくつかの遺伝子の絶対的重要性を定義します肝幹細胞、RAG-2 - T及びBリンパ球のクローンのブックマーク（レーピン、2001）。ヒトES細胞における遺伝子の二重削除が実行可能な種間雑種胚を得る可能性与えられた胚層、セグメンテーションとホメオシスとESC移植の遺伝子の機能的役割の研究へのアクセスをオープンしました。単一8細胞胚におけるドナーのPGCの移植の改善された方法を用いてレシピエント胚の多くの臓器の細胞レベルでそのキメラ証明。セルもやしが胚盤胞にヒト造血幹細胞の投与後にヒト組織レシピエントマウスの臓器で発見されていることに注意してください。それは、多能性ヒトES細胞を循環血液体の形成中にそのマウス胚で発見されました。彼らの生物学的機能は、将来の胎児の免疫系の組織であることも可能です。 - 運動失調、teleangektaziyuデュシェンヌ型筋ジストロフィー、シャットダウンATM遺伝子（制御信号合成キナーゼクロマチン）のマウスでダブルノックアウトモデルジストロフィン遺伝子：ESCとインビトロでヒト遺伝病の適切なモデルを再現しました。この場合、原因DNA修復の欠陥に子供の致命的な遺伝性疾患は、増殖細胞の死による胸腺の退縮を伴う小脳、中プルキンエ細胞の変性を開発しています。マウスキメラからESC異常な遺伝情報への導入を介して再生クリニック、病態生理学及びpatomorfologija失調-teleangek- taziiは、ヒトにおけるものに対応します。さらにのPGCおよびノックアウトマウスを使用して、運動失調、teleangektaziiが著しく関連疾患を治療するための新規な方法の前臨床試験のための実験薬の可能性を増加させた実験モデル、炭水化物および脂質代謝の障害に関連するいくつかの遺伝ホモ接合性のヒト疾患、アミノ酸の異化、銅およびビリルビンの除去を開発しました権利。

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幹細胞ハイブリッドの使用

ヒトES細胞から体細胞を融合することにより得られたハイブリッド細胞は、幹細胞の多能性および分化細胞の染色体の再プログラミングを研究するための適切かつ有望なモデルです。Tsitogibridy成体動物の分化細胞とESCの合併によって得られた、異なる「年齢」のゲノムとの間の関係を研究する機会を提供する：相同染色体が分化の様々な段階の細胞に由来する独特の状況を開発し、成熟の度合いを変化させ、同じ核、のどこにいる彼らは簡単にできますtransdeystvuyuschimiは調節シグナルを共有しています。相同染色体のtsisregulyatornyeエピジェネティックなシステムはYN時に既存どう反応するかを予見することは困難です 胚関連ゲノムから衝撃transdeystvuyuschih信号に応答してdividual開発、また、ハイブリッド細胞に別個の染色体レベルでのゲノムの相互作用を研究することを可能にする親の染色体の分離が起こる、すなわち、潜在的多能性の維持に特定の染色体の一部を識別し、又は逆に、差別化の出力。

異なる「開発の歴史」のゲノムの相互作用を研究するための最初の実験モデルとしてtsitogibridy使用teratokartsinomnyh多能性と分化した体細胞をマージしました。場合によっては、そのようなハイブリッド細胞は、多能性を十分に高いレベルで保持した。特に、インビボ奇形腫 - 体細胞ハイブリッド細胞は、3つ全ての胚シートの誘導体を含有する真の奇形腫の発生を誘導し、懸濁培養においてインビトロ胚様体が形成された。このタイプの種間の細胞質内でも、奇形癌細胞との体細胞パートナーがリンパ球または胸腺細胞を有する場合には、胚性抗原が注目された。奇形癌細胞と線維芽細胞との融合によって形成された細胞ハイブリッドは、表現型に従って線維芽細胞に対応することは注目に値する。

最も重要なのは、インteratokartsinomno体細胞ハイブリッド細胞は、個々の遺伝子または不活性X染色体体パートナーの再活性化によって特徴付けられる分化細胞の徴候ゲノム再プログラミングを、出現していることが確立事実です。このように、型tsitogibridahのteratokartsinomno-体細胞の研究の結果は、ハイブリッド細胞は、しばしばゲノムの多能性および再プログラミングを保持し、身体的パートナーの兆候があることを示しています。

実験では、マウスのESCの成体動物で脾細胞を融合することによって、胚種内雑種細胞を得るために親の染色体の特性ようtsitogibridov、分離分析を研究し、多能性ハイブリッドゲノムを評価しました。体細胞との融合奇形癌細胞によって産生さ間雑種細胞については、一般的に四倍体または近四倍体核型を有する染色体の低い分離によって特徴付け。初代性細胞とリンパ球との融合により、同様の染色体組成が細胞ハイブリッドで観察された。同時に、マウスのリンパ球細胞teratokartsinomnyhミンクの合併の結果として得られる種間雑種細胞は、染色体の強烈な分離体細胞パートナーがありました。

各マウス染色体を確実ハイブリッド細胞における相同染色体の任意の対の間を識別できるように、数百のマーカーを発見することにより雑種における親の染色体の分離の研究における質的に新しいステージは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、マイクロサテライト分析法の開発の後に来ました。

脾細胞とESK（gipoksantinfosforiboziltransferazy活性が欠損HM-1細胞を、2N = 40を使用して、胚盤胞のマウス系統129 / 01Aから単離されたXYを）マージしたマウスからコンジェニックラインDD / Cは、形態学的にハイブリッドクローンのセットを受信することができなかったヒトES細胞に類似していました。全てのクローンは、成長のみアクティブセルgipoksantinfosforiboziltransferazoyで可能である、選択培地上で単離しました。電気泳動分析は、すべてのクローンの対立遺伝子変異体gipoksantinfosforiboziltransferazy特性マウスDD / Cの存在を明らかにしました。細胞遺伝学的解析を使用して、4つの染色体の3個のハイブリッドクローンokolodiploidnyセットを持っていたことが判明しました。二倍体 - 一近四倍体クローンは、二つの四倍体であった一方がハイブリッド細胞の集団、および第二の、より小さなを含有していました。

相同染色体マウス129 / 01A及びDD / Cの任意のペアを識別することを可能にするマイクロサテライトの分析は、okolodiploidnymセットとハイブリッドクローン中のクローンは、2人の別個の優先的除去常染色体体相手に発生したことを示しました。ほとんどの常染色体クローンHESS2とHESS3は、すなわち、多能性パートナーをマーカーライン129 / 01Aを持っていました。例外は、染色体1であり、I：HM-1細胞を、マーカー本体パートナーの少数のマーカーと一緒にクローンHESS2とHESS3、。これらの結果は、染色体1および体パートナーの不完全な分離を反映し、その30~40％HESS2とHESS3細胞クローンで起こる染色体のトリソミー細胞遺伝学的データと一致していることができます。HESS4クローンは有意染色体組成が異なる：多くのこのクローンは、ゲノムESK由来する常染色体（染色体2、3、4、5、6、7、10、13、14及び17）が、染色体1、9、11、12、 15、16、18及び19は、両方の親のホモログを提示しました。1：マイクロサテライトマーカーの量比は、これらの相同染色体は、約1対応しました。分化した細胞から - これは、著者が1つのホモログは、ESCや他のゲノムに由来することを示唆することができました。クローンHESS4のいくつかのサブクローンでは、染色体18と19体細胞パートナーのトークンのみ存在することを観察しました。なぜなら染色体のtsitogibridov特性分離は唯一の現象は、かなり珍しいです - 結果は、染色体体細胞パートナーの分離に加えて、1以上の染色体の多能性ゲノムの両方の同族体の排除があった、すなわち、両方の親の染色体の両面分離があった細胞がHESS4のクローンを作成することを示しています両親のひとり。

また、20日経過後、ハイブリッド細胞の全てのクローンは、クローンにおいて体パートナーのX染色体上のX染色体ESCを置換した、つまり、体パートナーの唯一のX染色体マーカーを含みます。これは、マウスX染色体に特異的なFITC標識プローブを用いたin situハイブリダイゼーションデータによって確認される：陽性シグナルが1つの染色体上でのみ検出された。培養初期段階（第15継代まで）では、細胞遺伝学的データによれば、多くの細胞において2つのX染色体が存在したことに留意すべきである。結果的に、選択培地の使用により、ハイブリッド細胞の染色体組成を操作し、ESCゲノムのバックグラウンドに対して体細胞パートナーの単一染色体を有するクローンを選択的に標的化することが可能になる。

ゲノムtsitogibridovのユニークな特徴は、シングルコアでの親のゲノムの局在であるため、当然のことながら、分化した細胞のゲノムに密着の条件で多能性胚ゲノムESC-体細胞ハイブリッドの特性を維持する問題を提起します。形態学的には、ESCおよび体細胞の細胞ハイブリッドは、ESCの親系統に似ていた。資格の多能性は、存在する3つの胚葉の誘導体で胚様体の懸濁培養を中に形成することができた全てのクローンは、染色体のセットokolodiploidnymことを示しました。

ほとんどのハイブリッド細胞は、初期のマウス胚の特徴であるマーカーであるECMA-7抗原を含み、またアルカリホスファターゼの高い活性を有していた。ハイブリッド細胞の高い多能性特性に関する最も説得力のあるデータが、クローンHESS2のハイブリッド細胞を含む一連の注入キメラを得るための実験で得られた。生化学的マーカーの分析は、ドナーハイブリッド細胞の子孫がほとんどのキメラ組織において見出されたことを示した。その結果、ESCと体細胞分化細胞との融合によって得られるハイブリッド細胞は、胚盤胞腔に挿入されたときにキメラを形成する能力を含む、高レベルで多分化能を保持する。

クローンHESS2およびHESS4は、親染色体の組成において著しく異なるが、それらは同様の多能性を有していた。雑種ゲノムの多能性が支配的な特徴として現れると信じることができるが、胚ゲノムのすべての染色体が多分化能を維持する過程に関与しているわけではない可能性がある。この仮定が正しいとすれば、ハイブリドーマゲノムからの多能性パートナーのいくつかの染色体の排除は、それらの多能性状態の変化を伴わないことを期待することができる。この場合、胚ハイブリッド細胞における親染色体の分離の分析は、胚細胞の多分化能制御に関与する染色体の同定に近いアプローチを可能にするであろう。

セロフO.ら（2001）は、正常マウスとのキメラ、遺伝子型マウス129 / 01Aを有するであろうものの交配から得られた50の子孫の中に見出され、X染色体DDマウスを運びます。著者らは、体細胞ゲノムの影響下でのハイブリッド細胞の多能性の低下におけるこの理由を見いだす。別の説明は、常染色体及び性染色体の一部不均衡のためのトリソミーの負の影響かもしれない減数分裂の通路でハイブリッド細胞（XXYは15継代までの細胞で観察されました）。XXYの細胞は減数分裂を通過して配偶子を形成することができないことが知られている。トリソミーはまた、ハイブリッド細胞の増殖活性の低下を引き起こすことができ、その結果、キメラの発生における選択的利点は、レシピエント胚の細胞に属することができる。従って、ハイブリッド細胞の多能性の可能性を適切に評価するためには、正常な二倍体染色体セットを有するハイブリッドクローンを得ることが必要である。

実験でSerova O.ら（2001）は最初体細胞ハイブリッド細胞のゲノム中X染色体を再プログラミングの可能性を実証しました。この結論は、著者から次はキメラhprt遺伝子（X染色体マーカー）の発現を分析：対立遺伝子の存在は、HPRT DD / cマウスを、キメラ分析した全ての組織において検出された変異体です。非選択の条件に該当tsitogibridy胚盤胞のキャビティ内のハイブリッド細胞の導入とハイブリッド細胞のゲノム中のX染色体の保存後、そのゲノムの必須の構成要素となっているとY染色体多能性パートナーからそれを区別しないことを意味していることを強調しなければなりません。

著者らは、ハイブリッド胚細胞における体細胞性および多能性ゲノムの相互作用の分析結果を要約すると、いくつかのサイトハイブリッドにおいて、多能性はそれ自体が支配的な形質として現れると結論付けている。ハイブリッドゲノムは、分化細胞の個々の染色体を再プログラムすることができるが、体細胞ゲノムが胚ゲノムの多分化能に及ぼす逆効果の可能性を排除するものではない。ハイブリッド細胞の培養において、分化の誘導は、ESC NM-1の元の親系統よりもずっと頻繁に起こる。一次コロニーの形成においても同様の効果が観察される：胚ハイブリッド細胞の多くの一次コロニーは、選択および増殖中にクローンの大きな損失を伴って形成の初期段階で分化する。

したがって、分化細胞のゲノムとの密接な接触にもかかわらず、体細胞とのESCの融合によって作製されたサイトカイブリッドは、胚ゲノムの独特な特性として多分化能を保存する。さらに、そのようなハイブリッド細胞では、拡散した細胞に由来する個々の染色体を再プログラムすることが可能である。ハイブリッド細胞における胚性ゲノムの多能性、特にキメラにおける胚経路の形成に関与する能力は、いかに完全には依然として不明である。このためには、正常な核型を有する胚ハイブリッド細胞を得ることが必要である。いずれの場合においても、多能性胚性ハイブリッド細胞は、多能性または親染色体の両側分離は、潜在的にそのような機会を提供するなど、彼女の制御の維持に関与する染色体の遺伝子を同定するための実際のモデルとすることができます。

O. Serovと共著者（2001）が「染色体記憶」と定義しているこの現象の研究はあまり魅力的ではない。ホモログ多能パートナーに対し、このプロセスは始まったばかりである、同族体細胞パートナー一度受け分化：ハイブリッドゲノム中の相同染色体が2つの代替構成をしています。したがって、ハイブリッド細胞の高い多能性を維持することは、その「多能性」構成ホモログESCは、体パートナーから発するtransdeystvuyuschih要因の影響にもかかわらず、ハイブリッドゲノムにおいてかなり安定示します。キメラの開発中に再プログラミング分化相同ゲノム染色体の上述の特徴は、in vitroでの形成とtsitogibridov培養の最初の段階は、それらがインビボでの分化の間に取得されたその状態を維持する可能性を排除するものではありません。非選択培地中で胚ハイブリッド細胞を転送するときに最近のデータによると、唯一の体細胞パートナーの集中排除の染色体が存在である、すなわち、ハイブリッド細胞のゲノムは、簡単に10〜15回の継代のためのin vitro培養後ホモログを判別します。胚分化 - このように、胚ハイブリッド細胞は、基本的な多能性胚性ゲノムの性質だけでなく、その選択肢のない唯一の研究のための有望な実験モデルを表します。

胚性幹細胞移植の治療効果

ESC移植およびその派生物の治療効果を分析する前に、上記の材料を要約する。ESCをインビトロで胚の完全な実装の観点備え起因自律的かつ独立したhESCから体内で起こる間葉系幹細胞の非存在下にあるため、この場合の欠陥は不十分です。使用されていない胚のESCをクローニングするため、直接遺伝的効力ESK少ない遺伝性接合体。開発プログラムが全面的に実施されている唯一の細胞であるESCの独自の生物学的潜在性は、遺伝子の機能に関する研究に応用されています。ESKを使用すると、三の胚葉の開発のためのコード、初期および後期遺伝子の発現を活性化する第一の信号の組合せをデコード行わ。in vitroでのESCのゲノム多能性を維持することが、それらを自動的臓器や組織損傷を受けた細胞の損失を補償することができるの修復再生のためのユニークなツールになります。理想的な仮想的な実施形態では、効果的な形態学的として、レシピエントの体内に統合...「...レシピエント生物におけるドナーのPGCの移植に有利な条件の下でできる新しいtkani'7の建設で実現されているコンパクトにパッケージ化されたプログラムを転送している」と仮定することができます機能性と機能性の両方を備えています。

当然、ESCの単分化法の開発に続いて、単一の特殊クローンからインビトロで得られた細胞の機能的活性のインビボ研究が開始された。増殖するESOクローンは、再生プラスチック医薬品に使用されるレシピエントの組織損傷ゾーンに実際に積極的に統合可能な遊走前駆細胞の集団を生成する。黒質におけるドーパ - ニューロンの移植は、実験的ヘミパーキンソン症候群における臨床症状を減少させることが確立されている。ドナー神経幹細胞の局所移植は、脊髄および脳の外傷または挫傷によって引き起こされる運動障害の程度を低下させる。脱髄疾患における幹細胞移植の最初の肯定的結果を受けた。ESCの再生塑性潜在力は、実用的な医療において細胞移植を使用するための無限の可能性を開くようである。しかし、異所性領域に移植する場合、必然的に腫瘍に変化する。免疫不全マウスの奇形腫におけるESCの皮下注射が形成される場合。ESK懸濁液を同系マウスの精巣の莢膜の下に移植すると、奇形腫も形成され、異なる組織からなり、その細胞は3つの胚葉すべてに由来する。このような奇形腫においては、器官形成の減少過程は極めてまれである。

いくつかの研究は、ESCOの早期派生物の実験的な病理を有する動物への移植の肯定的結果に関する情報を提供する。PGCの誘導体を用いた細胞神経移植は、さらなる実験脳および脊髄外傷、脊髄空洞症および多発性硬化症（レーピン、2001）の治療における機能障害の補正の最初の臨床試験で開発されています。in vitroでの技術neyronogenezaのESCの出現、代わりの胚性神経組織の培養物から得たニューロスフェアの誘導体を、開発した胚の脳組織の移植技術を使用して。そのような移植懸濁液ははるかに均質であり、コミットされたニューロンおよび神経膠前駆体を含有する。

胚系統における6週間を10μg/ mlの用量でのレチノイン酸との定期的な培養培地に加え（奇形腫）有糸分裂後のニューロンの80％の上に形成されNTERA-2ヒト-kartsinomy。ニューロン集団の完全な均質性は残党teratokartsinomnyhと未熟細胞を取り除くことができ、成熟したニューロンのラベルされた免疫表現マーカーをフローソーティングすることにより達成されます。実験動物などの神経細胞の脳の異なる領域における移植後存続するだけでなく、地域のニューラルネットワークに埋め込まれていないだけです。局所欠陥の実験モデルを用いた動物においてCNSの神経移植は、頭蓋脳外傷、脳卒中、脱髄疾患、遺伝性小脳現像欠陥、脂質および多糖類の疾患堆積の効果としてヒト病態の臨床症状を減少させます。

中枢神経系の変性疾患における再生プロセスを最適化するために、ESKからのミエリン産生希突起膠細胞の調製技術が開発されている。第1段階は、伝統的に、移植に必要な細胞数の倍数でESCの増殖を伴う。第2段階では、選択マーカー抗原によって制御される、ミエリン産生希突起膠細胞前駆体の集団への細胞の指向性分化が行われる。

いくつかの見通しは、胸腺の成熟に遺伝的欠陥に起因する免疫不全を補正するための方法を開発するために使用デリバティブESCのために開かれています。ノックアウト研究（RAG 1）誘導される遺伝子欠損を有するマウスに - 違反組換え機構V（D）J遺伝子座TCR、Tリンパ球の機能の損失につながる、胸腺動物中のPGCの移植早期誘導体の責任免疫クローンの正常集団の成熟を回復します細胞性免疫。移植の臨床試験は、子どもたちに致命的な遺伝性の貧血を治療するためにin vitroヒトES細胞に予め形成されました。

幹細胞移植の迅速な導入は、ヒト胚性幹細胞の限られた数の安定した系統およびそれらの標準化の必要性によって正当化される。成体幹細胞と同様に標準化されたESC系統の純度を高めるために、DNAの短いタンデムリピートの分子遺伝学的解析に基づく線選択法が提案されている。小さな染色体再編成および遺伝子突然変異の存在についてESC系統を試験することも必要であり、細胞培養条件下でそれらが発生する可能性が十分に高い。インビトロでのそれらの複製は、胚または最終組織の幹細胞に内在しない新しい特性の出現を導き得るので、あらゆるタイプのESCおよび多能性幹細胞の特性の強制試験に関する論文が進められている。特に、サイトカイン培地中での長期間の培養は、細胞分裂を無制限に行う能力を獲得することによって細胞周期の調節の方法における同様の変化が起こるので、ESK系を腫瘍細胞に近づけることが許容される。いくつかの著者は、腫瘍の発生の可能性に基づいて、胚性幹細胞の初期誘導体のヒト移植を無謀と考えている。彼らの意見では、ESCのコミットされた子孫、すなわち分化した細胞の祖先の系統を使用する方がはるかに安全です。しかし、正しい方向に分化する安定したヒト細胞株を得るための信頼できる技術はまだ開発されていない。

したがって、文献には、ヒト胚性幹細胞誘導体の移植の陽性治療効果に関するデータがますます多くなっている。しかし、これらの作品の多くは改訂と批判の対象となっている。一部の研究者は、初期の臨床試験の結果は本質的に暫定的であり、幹細胞が疾患の臨床経過に有益な効果をもたらすことを示唆していると考えている。したがって、細胞移植の長期間の結果に関するデータを取得する必要があります。議論として、臨床的神経移植の発達段階が示されている。実際、文献に、最初はパーキンソン病における胚の脳移植片の高効率化の出版によって支配が、その後、患者の脳に移植胚または胎児の神経組織の治療効果を否定したレポートを表示されるようになりました。

移植神経芽細胞の安全性を評価する最初の臨床試験を行っ - のPGC NTERA-2奇形癌の誘導体を、培養で増殖未熟細胞は、ストレージ100万細胞塊に供しました。このようにして得られた細胞の一部は、細胞表現型および不純物の特性を決定するために、ならびにウイルスおよび細菌による汚染の可能性を試験するために使用しました。培養培地からLIF及びサイトカインおよび成長因子の組み合わせで神経芽細胞へのhESCの有向分化のための条件を作成した間質細胞および胎児のフィーダー層を除去しました。次いで、フローケージソーター上の未成熟奇形癌細胞から神経芽細胞を精製した。移植細胞の神経芽細胞の表現型の第二の精製および特徴付け後（10-12万円）特別なシリンジおよびmicrocannulas定位及びCTの制御下を用いて懸濁液を患者の脳（出血性脳卒中後の第七の月）の基底核に注入しました。ストロークゾーンにおける神経細胞の移植の効果をスクリーニングOdnogodovoy移植後には有害と不要な効果がないことを明らかにしました。患者の半分は、移植後6ヶ月から12ヶ月の間に運動機能の改善を経験した。35％ - 係るポジトロン放出断層撮影は18％に達し、一部の患者では、蛍光標識した2-デオキシグルコースの平均吸収の増加は正の臨床変化は、細胞の移植後の血液供給ストロークゾーンの増加を伴いました。

しかし、米国国立衛生研究所は、パーキンソニズム患者の神経移植の臨床的有効性について独立して研究した。第1群の患者にドーパミンを産生する胚神経組織を移植し、第2群の患者には誤操作を施した。この結果は、ドーパミン産生胚ニューロンがレシピエントの脳内で生存したにもかかわらず、そのような神経移植の臨床的有効性がゼロであることを示している。また、患者の15％で胎児の神経組織の移植後2年間は、プラセボ群の患者には存在しない持続的な運動障害、開発後（幹細胞：健康米国の科学の進歩と今後の研究の方向性ナット研を、...）。これらの患者における疾患のさらなる発達の観察が続く。

一部の著者は、患者グループ、彼らの状態を評価するための客観的な方法の不適切な選択肢の選択に異なるアプローチで臨床的有効性の神経移植データの評価に関する矛盾した文献を属性と、最も重要なのは、胎児の神経組織の織物は、異なるサイズで生産された脳のさまざまな部分で、開発の異なる用語手術の移植および方法論的特徴を含む。

実験的な身体gemiparkinsonizmomラットの脳の線条体部位に多能性胚性幹細胞の移植を指示しようとESCの増殖およびドーパミン作動性ニューロンへの分化を伴うことに留意すべきです。移植後のESCは、アポモルヒネ試験で挙動および運動非対称性の異常の補正を観察されたように、新たに形成されたニューロンは効果的に神経ネットワークに組み込まれているものとしなければなりません。同時に、脳腫瘍に移植されたESKの形質転換のためにいくつかの動物が死亡した。

米国国立医療アカデミーの専門家は、国立衛生研究所の専門家は、ヒトES細胞の臨床的可能性が深刻な注目に値すると信じて、しかし、合併症およびヒト疾患の十分な生物学的モデルを用いた実験では長期的な影響の可能性が（幹細胞、それらのプロパティの詳細な研究の必要性を主張し、将来の再生医学、National Academy Press、幹細胞および将来の研究方向性、Nat。Inst、of Health USA）。

この観点から、含まによる移植初期胚に開発した奇形腫、と精巣スラリーのPGCに移植することにより得られた実験テラトーマの比較組織学的分析はまた、本ESCが示されたことは重要であるESKかかわらず、それらの起源又は相互作用のそれらの細胞または他の周囲の細胞によって、それらの腫瘍形成能を実現する。それが発生する可能性があり、腫瘍のESCからのような奇形腫は、3つのすべての胚葉（.Rega、2001）の誘導体からなる、クローン起源を持っていることを証明しました。免疫不全マウスに移植した場合には、正常な核型および分化した体細胞の様々なタイプのからなる形成された奇形腫でのPGCクローニングことは注目に値します。これらの実験データは、奇形のクローン起源の完全な証拠である。発生生物学の観点から、彼らはそれがコミット前駆細胞および多能性幹細胞アイデンティティの倍数ではないすべての3つの胚葉の差別化誘導体、奇形腫コンポーネントのソースであることを示唆しています。法外でない場合は、これらの研究の実用的な細胞移植の結果がある中で、その後、接種ESCまたは成人免疫不全マウスの異なる組織における始原生殖細胞から潜在的な危険の警告サインは、必然的に移植された幹細胞から腫瘍の発生の原因となります。分化した細胞の衛星集団の出現を伴う腫瘍性変性異所性移植ESC - 部分的差別によっては確かにESCのと前駆クローン専用回線です。興味深いことに、ESCを奇形癌細胞の隣の骨格筋に移植すると、ニューロンが形成されることが最も多い。しかし、投与したPGCにメイスの卵や胚盤胞は、腫瘍細胞を形成することなく、生殖細胞での完全な統合を伴います。この場合、ESCは性的基盤を含む事実上すべての臓器および組織に組み込まれる。このようなアロフェニクス動物は、奇形癌129の細胞を8〜100細胞の段階で初期胚に導入することによって最初に得られた。細胞由来のドナーのPGCは、骨髄、腸、皮膚、肝臓や性器に導入されているgeterogenomnyh allofennyhマウスの集団では、それはあなたが実験でも、種間の細胞キメラを作成することができます。細胞キメラ化、造血系で観察された最高度のキメラ化、皮膚、神経系、肝臓と小腸allofennogo胚の割合が高い、初期胚の時に小さいです。レシピエント組織germenativny層にドナー幹細胞の挿入に伴う精巣実質内移植始原生殖細胞：成体生物の組織受け入れキメラは、レシピエントgistogematicalkie障壁の免疫系への曝露から保護します。しかしながら、生成ドナー始原生殖細胞と胚盤胞形成キメラ原基生殖器へのESCの移植は発生しません。特別な条件を作成およびクローニングのために使用することができるESCの多能性：8-16セルマウス胚、tsitokalazinomが遮断前記細胞の有糸分裂をESC移植マウスは、胚ドナーのPGCの開発と正常胚発生に寄与する。

したがって、別のは、次に遺伝的に同一のドナーのPGC体細胞核のラインを割り当てられた胚盤胞から内部細胞塊を作成するために、除核卵母細胞への体細胞核移植に基づく同種ESC治療的クローニングの移植です。技術的には、このアイデアは、繰り返し実験動物での実験で証明した除核卵細胞への体細胞核を移植した後に得られた胚盤胞からのhESC株の創出の可能性があるため、実現可能である（ナジ、1990; Munsie、2000）。ドナー核を除核した卵母細胞に移植されるように、特に変異RAG2に関してホモ接合性マウスにおいて、表皮下組織細胞を培養することによって得られた線維芽細胞を使用しました。活性化後、卵母細胞を「接合体」培養胚盤胞形成まで、内部細胞塊を単離したPGCであり、変異遺伝子nullizigotnyh細胞（RAG2 - / - ）のためのラインにそれらを通過します。そのようなESCにおける相同組換えにより、1つの対立遺伝子の突然変異が修正された。ヒトES細胞の組換え遺伝子から最初の一連の実験では、胚様体は、組換えレトロウイルス（HoxB4i / GFP）で静脈RAG2 - / - 注射したマウスにおいて増殖した後、その、トランスフェクトされた細胞を調製した回収。第2シリーズでは、四倍体割球を遺伝子組み換えESCと凝集させ、それらの雌レシピエントに移植した。生まれた免疫担当マウスは、突然変異マウスrag2〜/〜に移植するための骨髄ドナーとして役立った。3-4週間、通常の成熟骨髄性とリンパ系細胞の全てのマウスにおいて、免疫グロブリンを産生することができることが見出された：両方のシリーズでは、結果が陽性でした。遺伝情報の補正を輸送するためのベクターとしてESCを使用して遺伝的異常の矯正 - したがって、体細胞の卵母細胞の核への移植だけでなく、tsitogenoterapiiためのhESC株を生成するだけでなく、使用することができます。しかし、細胞移植のこの方向では、生命倫理上の問題以外にも限界があります。このような細胞は、特定の疾患の素因を作成する変異を導入することができますので、移植は、治療上、特定の患者の遺伝子型と同一の遺伝子型を有する細胞をクローニングすることだろうか安全で明確ではありません。除核動物卵母細胞に体細胞の核を移植する場合でも、唯一の百分の15から25は、胚盤胞期に発達「受精卵を」操作のに対し、正常なヒトの卵は、アクセスできないオブジェクトのまま。多能性クローンESCの単一系統を得るためにどれだけの胚盤胞が必要であるかは決定されていない。治療クローニング方法論の複雑さに関連する高いレベルの財務費用に留意すべきである。

結論として、ESCの多能性ゲノムにDNAがのPGCは、二倍体染色体および表現型の特徴の「少年」のセットを保持する間に集中し、潜在的に無限の乗算を保証高いテロメラーゼ活性と短いC ^細胞周期相と組み合わされる低メチル化。文化の中でのPGCのクローン成長は、彼らが停止線の増殖で生物のいずれかの特殊な細胞に分化し、適切な規制の信号を加算妨げるものではありません。インビトロ体細胞におけるラインにおけるhESCの制限分化はNohteyaovをバイパスし、間充織の参加なしで実現され、器官形成および胚の形成なしです。インビボでのESCの異所的投与は必然的に奇形癌の形成につながる。胚の組織とその安定したキメラ化団体との統合を伴う胚盤胞または初期胚へのESC移植。

細胞移植に基づいて回生とプラスチックの技術は、細胞生物学、発生生物学、遺伝学実験、免疫学、神経学、心臓病、血液学、実験や実用的な医学の他の多くの分野のメンバーの利益の交点です。心筋再生、CNS病変の修復および膵臓の膵島装置の機能の正常化のための - 最も重要な実験結果は、成長因子と細胞分化プロセスを制御するための展望を開くそれらの特性の変化の方向と幹細胞を再プログラミングの可能性を証明します。しかし、医療現場で広く導入移植誘導体ESCは、疾患の実験モデルでのPGCをより詳細にヒト幹細胞の性質およびさらなる実験を調査する必要があります。

生命倫理の問題と同種細胞移植の拒絶反応の問題は、地域の成体幹細胞のゲノムの観測された可塑性を解決することができます。しかし、初期情報を単離し、徹底的に肝小葉の中に取り入れた新しい肝細胞が存在しているうち自家造血細胞を、特徴肝臓を移植する際に、今検討し、批判されていることです。しかし、胸腺における神経幹細胞の移植はドナーの骨髄細胞および赤血球生成を持続ドナーT-およびBリンパ球の新芽の形成され、骨髄中の脳の神経幹細胞を移植する造血胚の形成につながるというデータを発表。その結果、成人の臓器で容量にESCのゲノム再プログラミングが可能な多能性幹細胞を保存することができます。

人間の胚は医学目的でESCを受け入れる源であり、人間の生命の誕生時に道徳的、倫理的、道徳的、法的、宗教的問題の新たな交差点の必然性を事前に定めている。ESCの発見は、生きている細胞と物質と物質と人格との間の線がどこにあるかに関する厳しい議論の再開に強力な刺激を与えた。同時に、医学におけるESCの使用に関する普遍的な規範、規則、法律は存在しません。法律上の各州は、この問題を単独で解決します。そのために、世界中の医師は、主に非胚性幹細胞と成体生物の幹細胞埋蔵量の使用を通じて、このような議論を超えて再生医療用医薬品の開発を続けています。

胚性幹細胞単離の歴史のいくつか

Terato-（胚）細胞が自発卵巣奇形腫のマウス系統Ltの/ SVは、-kartsinomnyeが自発的に精巣奇形腫のマウス系統129 / TER-SVは発生から単離された、および奇形腫から、ektopichno源は細胞または胚組織を移植しました。多能性であり、したがってterato-得られた安定なマウス系統（胚）-kartsinomnyhいくつかのセルのうち、他のものは、ただ1つの特定の型の細胞に分化に供し、そしていくつかは細胞分化の一般的に不可能でした。

時、フォーカスが-kartsinomnyhインビトロで遺伝的に改変さterato-（胚）を作成することが可能と戻りterato-（胚に）-kartsinomnyh現像胚組織におけるそれらの導入後に正常な表現型への細胞、ならびに作業を示した研究でしたヒトの遺伝病理学の生物学的モデリングのために突然変異体マウスが得られた。

Terato-線（胚）を単離するために、細胞懸濁培養-kartsinomnyh空調に使用されています。細胞-kartsinomnye培養terato-（胚）において、ESCのように、胚様体を形成するために成長し、胚線維芽細胞または馴化培地中の懸濁培養のフィーダー層上で多能性を維持解離結合線に変換することを必要とします。Terato-多能性細胞（胚） - 大きい、球状癌線は、アルカリホスファターゼ、フォーム凝集体の高い活性を有し、多方向分化が可能です。胚盤胞に導入された場合誘導体terato-（胚）-kartsinomnyh細胞に見出される様々な器官及び組織において、キメラ胚の形成をもたらす、桑実胚と凝集されています。しかし、このようなキメラ胚の大半は、子宮内で死亡し、臓器にキメラを生き残った新生児外来細胞をめったに低密度で検出されません。同時に腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫、および悪性腫脹および腺腫膵臓の他のタイプの）急激に増加、及び腫瘍性変性の発症率は、多くの場合でも子宮キメラ胚において起こります。

正常胚細胞の微小環境中の大部分の胎生胚 - 癌腫細胞は、ほとんど自然に悪性新生物特性を獲得する。不可逆的な悪性腫瘍は、構造的再編成過程における癌原遺伝子の活性化に起因すると考えられている。一つの例外は、細胞株は、キメラマウスにおける腫瘍のその後の形成なしに組織および胎児の器官に統合する高い能力を示すマウス精巣（ライン129 / SV-TER）に由来SST3、奇形腫をembriokartsinomnoyあります。キメラマウスにおける奇形 - 胚 - 癌腫細胞株の誘導体は、実質的に初代のゴン球の形成に関与しない。明らかに、これは、細胞が異数性または染色体異常として観察された最もterato-（胚）-kartsinomnyh線に共通染色体異常の高頻度で接続されています。

いくつかの安定terato-線-kartsinomnyhヒト細胞は、実験室条件下で調製した（胚）は、多能性、高い増殖活性及び増殖中の培養に分化する能力を特徴とします。特に、terato-ライン（胚）は、神経細胞分化のメカニズムを研究するために使用ホロノミックNTERA-2ヒト細胞-kartsi-。移植後、新生児ラットの前脳の脳室下域におけるこの行のセルとその移行がneyronogenez観察されました。著者によれば、疾患の臨床的改善につながる、脳卒中を有する患者に、-kartsinomnoy線NTERA-2細胞（胚）を培養することによって得られた神経terato-を移植する試みがなされてきました。脳卒中患者に移植された細胞（胚）terato-この場合悪性-kartsinomnoy線NTERA-2で言及されています。

エバンスとマーティンは、1980年代初めにマウスの未分化多能性胚性幹細胞の最初の系統を受け取り、それらを胚盤胞の内部細胞塊から単離した。単離されたESC系統は、多能性が長く保存されており、特殊培地の因子の影響を受けて異なるタイプの細胞に分化する能力を保持しています。

「胚性多能性幹細胞」という用語は、腫瘍発生の頻度にタバコのタールの影響の調査は、対照群のマウスの線形の自発精巣奇形（129 / V）の発生に注意を引いたことリロイスティーブンスに属します。精巣奇形癌細胞は高い増殖速度によって特徴付けられ、そして自発的神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、心筋細胞の分化、並びに毛髪及び骨断片の形成を伴う腹腔内に残された液体の存在下で、しかし順序付けcytoarchitectonics適切な組織の兆候なしにしました。奇形癌細胞培養物中で植えたときに基板多能性クローンに付着していない成長し、形成された胚様体は、次いで、ニューロン、グリア細胞、筋細胞および心筋細胞に分化クエンチし、自発核分裂無秩序に供しました。スティーブンスは、分化がそれらに影響を与える要因に依存奇形マウス129 / vが専門体ラインの多様に分化し得る細胞の1％未満を含有することが見出され、それ自体（組成腹水、製品は、成熟細胞又は組織の培養物に添加しました）。奇形癌細胞の間で存在約リロイスティーブンソン仮定胚性前駆有性生殖細胞を確認した：成体マウス組織における着床前胚細胞embryoblast懸濁液が奇形を形成し、レシピエント動物に腹腔内投与は、ニューロン、心筋細胞および他の体kletkiに分化した後、そこから純粋な細胞株を分離3つ全ての胚葉の誘導体。異なる段階線8-32割球におけるマウス胚のin vivo移植ESK（embryoblastから得られた栄養膜ではない）での実験ではもやしドナー組織を検出する器官におけるキメラ動物（非腫瘍形成）の出産を終えました。性細胞株でもキメラ現象が認められた。

プライマリ始原生殖細胞は、奇形癌スティーブンソンとembryoblastに由来のhESCと一致するマウス胚生殖性別、形態、免疫表現型および機能的特徴から単離されました。胚盤胞へのhESCの投与後に生まれたキメラにおいて、allofenny臓器形態形成は、肝臓、肺および腎臓の交互のドナーとレシピエントモザイク構造的および機能的単位を特徴とします。多くの場合、レシピエント細胞とドナー細胞とを同時に含む肝臓の腸陰窩又は小葉の形成が観察された。しかしながら、形態形成の実現は、レシピエントが属する種の遺伝子プログラムに従って常に行われ、キメラリズムは細胞レベルのみに限定された。

そして、特殊細胞要素の大多数が死亡しながら、フィーダー層由来間葉系細胞（胎児線維芽細胞）上の細胞分化なしのhESCの増殖が、LIFを選択的に幹細胞および前駆細胞の唯一の生存を提供する選択的栄養培地での結合の存在下で起こることがわかりました。ジェームズ・トムソンによって1998年にこれらの技術の助けを借りて胚盤胞の人の内部細胞塊から胚性幹細胞の不死化5行を割り当てられました。その同じ年、ジョン・ゲルハルトは四から五週間のヒト胚の性的パフから不滅ESCラインを単離する方法を開発しました。、そのユニークな特性のために、わずか2年後の胚性幹細胞と決定的な組織が再生医療や遺伝子治療の実際に使用され始めている幹細胞。