胚性幹細胞

胚性幹細胞の発見は偶然ではなく、発生生物学分野における科学研究の土壌の中で生まれたものです。「幹細胞」という用語が医学に導入されたのは、1908年、ベルリンで開催された血液学会において、アレクサンダー・マクシモフが造血細胞に関連して用いたときでした。多能性胚性幹細胞の安定した株が単離・作製されるはるか以前から、幹細胞である奇形（胚性癌）細胞は初期発生過程の研究に用いられ、それらの助けを借りて、初期遺伝子の発現配列やそれらの活性タンパク質産物を含む、胚発生の未知のメカニズムが研究されました。

しかし、ヒトゲノムの全能性は進化の過程で回復不能に失われてしまうのでしょうか？いいえ、胚発生がその証拠です。もしそうだとしたら、原理的に、進化の第二の道はいつ実現するのでしょうか？おそらく、人類が宇宙に進出し、環境条件が十分に長期間にわたって比較的一定になる時でしょう。骨組織の喪失（無重力状態における骨の脱灰）は、非常にゆっくりと再構築と再生を繰り返すため、人類という種が宇宙環境に適応する過程における最初のステップとみなすことができます。しかし、進化の第二の道の代償は異なります。全能性と絶対的な可塑性をすべての細胞に取り戻す代償は、不妊症です。つまり、この「進化のカメレオン」の世界では、私たちは減数分裂を経ずに出芽によって生殖しなければなりません。しかし、私たちは長生きするでしょう。テロメラーゼによる不死は、アメーバの不死です。多細胞生物において、幹細胞は量的および質的な長寿の基盤となります。

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胚性幹細胞の供給源

現在、研究用胚性幹細胞の供給源として、マウス奇形癌細胞株（129/sv、F19、F8、Zin 40、CGR 86、Rl、CCE、JM-1、E14TG2a、CGRSb）、ヒト奇形癌細胞株（NTERA-2、TERA-2、H-9クローン）、そしてTrauneon ESC株が用いられています。しかし、免疫表現型、染色体分析結果、mRNA発現プロファイル、露出受容体、細胞内シグナル伝達タンパク質などを示す詳細な細胞パスポートが利用可能であるとしても、奇形癌ESC株の重大な欠点、すなわち全能性の急速な喪失と臨床試験への使用の不可能を補うことはできません。また、培養における混合分化により、異種細胞集団から純粋に分化した細胞株を単離することが非常に困難です。したがって、臨床目的で作成される ES 細胞株のソースは通常、胚盤胞の内部細胞塊、8 細胞期胚の個々の割球、後期胚の桑実胚細胞、および始原生殖細胞です。

テラトカルシノーマ細胞は多能性を有するものの、ES細胞と比較すると多能性ポテンシャルが著しく低いことに留意すべきである。テラトカルシノーマ細胞を胚細胞と融合させてもキメラが形成されることは稀であり、キメラ細胞はテラトカルシノーマ細胞の遺伝子型を持つ配偶子を形成することさえない。これは、テラトカルシノーマ細胞の培養中にY染色体の喪失、様々なトリソミー、欠失、転座といった染色体異常が頻繁に発生するためと考えられている。

ヒト ES 細胞株を分離する試みは繰り返し行われてきましたが、正常なヒト胚盤胞の入手が困難であるため、この課題は未だ解決されていません。さらに、ヒトの染色体異常の頻度は動物の胚発生よりも高いです。体外受精で得られた初期ヒト胚の圧倒的多数は、無秩序な染色体モザイクを示し、数的および構造的異常を有することが少なくありません。さらに後の胚盤胞段階においても、正常な核型の細胞を含むヒト胚はわずか 20～25% です。このような胚を用いて ES 細胞を作成することは事実上不可能でした。なぜなら、接合子は通常、2 または 4 割球の段階まで培養してから子宮に移植されるからです。比較的最近になってようやく、ヒト受精卵を胚盤胞段階まで培養する信頼性の高い技術が開発されました。この技術を体外受精の実践に導入することにより、着床成功率が向上しただけでなく、正常な胚盤胞がより入手しやすくなりました。

もう一つの多能性幹細胞源は始原生殖細胞であり、これは生殖上皮のより発達した前駆細胞集団とは異なり、表面にβインテグリンを持たないが、アルカリホスファターゼの活性が高い。始原生殖細胞から形成された幹細胞集団は、1980年代から実験的に研究されてきたことに留意すべきである。当時、マウス胚の生殖腺の原基から始原生殖細胞を分離する技術が開発された。始原生殖細胞を体外で培養した最初の失敗結果は、これらの試みが無益であることを示唆していた。なぜなら、細胞は生き残ったものの、増殖せず、1日以内に死んだからである。その後、マウス始原生殖細胞は、培養培地中に可溶性で膜結合型の特定のポリペプチド成長因子が存在する場合にのみ、体外で増殖することが確立された。多くの研究結果から、初代生殖細胞の生存と増殖には、培養液中にLIFだけでなく、膜結合型で可溶性のSteel因子（SIF）が存在することが必要であることが示されています。これらのペプチドは、Steel変異のホモ接合体を有する胚の体細胞によって産生され、その1つはcKitプロトオンコゲンのリガンドです。

哺乳類およびヒトの一次生殖細胞は性腺外起源であり、生殖細胞株のクローン発生の源です。始原生殖細胞株、およびすべての胚組織と胚体外中胚葉の起源は、モザイク構造を持つ初期胚の上胚葉（一次外胚葉）です。初期胚のさまざまな部分を顕微手術で除去する方法を使用して、始原生殖細胞のコミットされた前駆細胞のクローンの上胚葉における局在領域を確立しました。細胞マーカーとして使用されたローダミンデキストランを使用して、始原生殖細胞の前駆細胞が胚体外外胚葉の近くの上胚葉の近位領域に局在していることが確立されました。始原生殖細胞株は45細胞のクローンから発生し、その分配は原腸形成の最初期に発生します。その後、クローン細胞は分離し、胚葉形成期には一次生殖細胞が胚体外中胚葉に入り、尿膜原基基部、一次条線の後ろで見つかります。そこから一次生殖細胞は後腸内胚葉の腹側部分へと移動し、その後腸間膜に沿って活発に動き、移動の終わりには生殖隆起に集まります。移動中、そして生殖腺原基に局在する最初の2～3日間、一次生殖細胞は活発に増殖し、8回の複製周期を経ます。移動開始時に一次生殖細胞が約50個ある場合、発育12日目のマウス胚の生殖隆起では一次生殖細胞の数が25,000個を超えます。

ES細胞と始原生殖細胞の機能的類似性は、ES細胞が胚盤胞に完全に統合され、内部細胞塊が置換され、その後、始原生殖細胞の子孫組織のみで構成される胚が本格的に発達することによって証明されます。マウス始原生殖細胞は他の特性においてもES細胞と同一であることが判明しており、様々な方向への分化能、in vitroにおける胚様体形成能、そして免疫不全マウスに皮下投与した際にin vivoで奇形腫を形成する能力を示しました。この奇形腫は、129/terマウスの自然発生的な精巣奇形腫に類似しています。

培地にLIF、膜結合型および可溶性SIFを添加すると、8日齢のマウス胚から単離した初代生殖細胞は培養液中で4日間生存し増殖するが、その後死滅することがわかった。また、培養液中で初代生殖細胞の死が観察される時期は、マウス胚の発生段階（12.5～13.5日）と一致し、この段階では雌初代生殖細胞は生殖腺原基で減数分裂に入り、雄初代生殖細胞では有糸分裂が阻害される。しかし、成長因子LIFとSIFだけでなくFGF2も培地に添加すると、初代生殖細胞は増殖を続け、継代培養において培地から成長因子（SIFとFGF）を除去した後でも増殖可能な細胞のコロニーが形成される。このような細胞は、可溶性成長因子LIFを添加せずに、胚線維芽細胞基質上で長期間培養することができる。始原生殖細胞から得られたこれらの安定した細胞株を胚性生殖細胞（ES細胞）と呼ぶことが提案されました。しかし、この用語は全く適切ではありません。なぜなら、EG細胞を培養しても、卵形成や精子形成といった後続段階を遂行できるES細胞を得ることは不可能だからです。これは、EG細胞株が始原生殖細胞に由来するものの、培養中にES細胞の特性を獲得すると、生殖系列への分化能力を失ってしまうためです。言い換えれば、始原生殖細胞は培養されると配偶子前駆細胞の特性を失い、ES細胞様多能性細胞へと変化するのです。

EG細胞を免疫不全マウスに導入しても、奇形腫は発生しないことが報告されています。ヒトEG細胞が奇形腫を生じないのは、これらの細胞株が培養された初代生殖細胞から直接作製されたのではなく、胚様体から単離された細胞から得られたためと考えられます。したがって、これらの細胞株は多能性を有しながらも、既に分化が決定されている細胞の子孫である可能性があります。

EG細胞と始原生殖細胞の間には根本的な違いがあることに留意すべきである。後者ではキメラマウス胚を得ることができない。これは、始原生殖細胞が内部細胞塊または栄養外胚葉に統合する能力を欠いていることを意味する。始原生殖細胞集団の特性は、後期胚の体細胞のコミットラインに類似しており、これを胚盤胞に導入してもキメラ胚の形成には至らない。

EG細胞の凝集によって得られる胚様体の培養技術を改良することで、選択培地を用いた選抜により、「胚様体由来細胞」（EBD細胞）と呼ばれる多能性細胞集団を得ることが可能になりました。EBD細胞は培養下で長期間増殖できるため、分化誘導された細胞から安定した細胞株を作製することが可能になりました。分化誘導された細胞のmRNAおよびタンパク質マーカーを幅広く発現するクローン細胞が得られました。この手法により、ヒト初代生殖細胞は多能性を有し、in vitroにおいてニューロン、神経膠細胞、血管内皮細胞、造血細胞、筋細胞、内胚葉細胞など、様々な細胞種に分化することが最終的に証明されました。

胚性幹細胞の代替源

ヒトES細胞株の代替源として、ハイブリッド細胞が挙げられます。ヒト胎児の体細胞と前核をあらかじめ除去したウシ卵子を電気穿孔法で融合させた異種細胞を、擬似妊娠ウシの子宮に移植することで、着床前段階の人工胚から内部細胞塊を得ることができます。この目的のために、まずヒト細胞核を移植したウシ卵子から胚盤胞を採取します。

第2段階では、胚盤胞から胚芽細胞を分離し、トムソン法を用いてES細胞を分離します。注目すべきは、この方法を用いたES細胞株の分離において、冬眠状態で人体内に残っている濾胞細胞または初代生殖細胞の核を用いた場合に最良の結果が得られたことです。これは、牛の卵子に移植されたヒト細胞の核は、短縮していないテロメアと高いテロメア分解活性を持つ必要があり、それが雑種卵子から得られたES細胞クローンの早期老化を防ぐのに役立つためです（Repin、2001）。ES細胞の最も重要な細胞内マーカータンパク質は、いわゆるクロマチンサイレンサータンパク質に属するOct3、Oct4、Tcf、Grouchoであることが知られています。サイレンサーは、特にコンパクトなヘテロクロマチンパッケージを提供し、ユークロマチンループの形成を防ぎます。これらのタンパク質を介したクロマチンパッケージングは、ES細胞ゲノムの全能性と相関しています。これまでに、成熟したウシおよびヒト卵母細胞は、細胞質内に高濃度のサイレンサータンパク質を含む唯一の特殊細胞であることが確立されています。これに基づき、除核したウシ卵母細胞に体細胞核を移植することでハイブリッドES細胞を得る方法が開発されました。予備的なin vitro研究では、ウシ卵母細胞の細胞質は、培養開始から12～24時間後にヒト体細胞核ゲノムの全能性を回復することが示されています。

特に興味深いのは、ヒト胚の着床前発生の特異性に関するデータであり、マウスよりも遅く、全能性細胞が多能性細胞集団に置き換わったことを示しています。細胞形質転換に関する研究では、ES細胞に加えて、ヒト胚盤胞の内部細胞塊の細胞からも栄養芽細胞が発生することが示され、その全能性が示されています。

胚盤胞期には、異なる役割を担う2つの細胞集団が形成されることが知られています。1つは胚盤胞の外層、すなわち栄養外胚葉を形成し、その派生物は栄養芽細胞と胎盤の他の胚性成分です。もう1つの細胞集団は、栄養外胚葉の内面に接する密集した塊を形成します。内部細胞塊の細胞集団の派生物は、胚の器官の組織と原基です。後期胚盤胞期には、内部細胞塊から胚体外内胚葉が形成され、胚盤葉上層（一次外胚葉）が形成されます。この場合、胚盤葉上層細胞は多能性を保持しますが、胚体外内胚葉の細胞を分化させる能力は制限されます。

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ヒト胚性幹細胞の入手

最近まで、栄養芽細胞からES細胞を得ることは不可能だと考えられていました。しかし、胚盤胞から単離した二倍体栄養外胚葉幹細胞株は、LIFの代わりにFGF2とヘパリンを含む培地中で増殖し、幹細胞へと分化しました。培地からFGF2を除去すると、栄養外胚葉細胞の増殖は停止し、染色体の核内複製が始まり、栄養外胚葉細胞成分は徐々に巨大栄養芽細胞へと分化します。LIFが栄養外胚葉細胞の増殖を刺激しない理由は、FGF2が血漿受容体（FGFR2）に結合し、細胞質内のMAPキナーゼであるERK1とERK2を活性化するという、異なるトランスシグナリング機構を活性化するためと考えられます。その結果、胚盤胞細胞において一つのシグナル伝達経路（LIF - gpl30 - JAKキナーゼ - STAT3）が活性化されると、内部細胞塊の細胞は多能性ES細胞へと転換し、膜貫通シグナル伝達のもう一つのメカニズム（FGF2 - FGFR2 - MAPキナーゼERK1/ERK2）が活性化されると、胚盤胞内に栄養外胚葉幹細胞が形成される。シグナル伝達経路の選択は、oct4遺伝子の活性に依存する。POUドメインに属するこの遺伝子は、常染色体17のt遺伝子座に位置し、卵形成期、卵割期、胚盤胞内部細胞塊の細胞、そして一次生殖細胞において発現する。 oct4 遺伝子の機能的な役割は、多能性細胞の出現、分化、脱分化に必要な転写因子をコードすることです。

ES細胞におけるoct4遺伝子の発現は、この転写因子と補因子との相互作用によって変化する。胚盤胞におけるoct4遺伝子の発現を誘導的に制御した結果、oct4の活性が低下すると細胞の半数が栄養外胚葉を形成するのに対し、oct4の誘導発現が増加すると、主にES細胞が分化することが明らかになった。

この実験では、卵割期、胚盤胞形成期、および胚発生のそれ以降の段階で全能性割球を培養している間は、ES細胞を細胞株に移植することはできません。マウスES細胞は通常、妊娠3.5～4.5日目に分離されます。これは、通常の胚発生の第6段階（単層胚盤胞）および第7段階（二層胚盤胞 - 初期卵円筒）に相当します。明らかに、マウス胚には着床前期にのみES細胞に変換できる細胞集団が含まれます。したがって、ES細胞株の分離は胚発生の特定の段階でのみ可能です。卵割中に発生する接合子と割球は、胚膜と胎盤を持つ生存可能な胚を発達させる可能性の観点から、全能性があります。生殖細胞の全分化能の喪失は、後期桑実胚期に始まります。この段階では、割球の更なる分化は、その位置に依存します。桑実胚初期の割球は全能性を保持しており、これは、位置の反転など、割球の局在を変化させる実験的操作によって、成熟した胚への発達が妨げられないためです。

ES細胞を細胞株に分離する効率は、胚盤胞の移植時の状態に影響を受けることが確立されています。妊娠3.5日目に卵巣摘出を行い、プロゲステロンを投与したマウスの生殖器官内で7日間の休眠をモデル化した胚盤胞を用いることで、胚性幹細胞株の分離効率が向上します。このような条件下では、内部細胞塊を形成する割球の数が増加すると考えられます。また、細胞周期が延長し、ほとんどの割球がG0期に入る可能性も考えられます。

さらに、安定した多能性ES細胞株の作製は胚の遺伝子型に依存します。129マウス系統の胚盤胞からはES細胞を比較的容易に分離できますが、CS7BL/6マウスではES細胞を得るのがはるかに困難です。また、CBA/Caマウスの胚盤胞からはES細胞株を分離することは事実上不可能です。明らかに、初期胚には多能性ES細胞株の発達に影響を与える遺伝的特徴がいくつか存在します。しかしながら、単離した上胚葉を培養し、分化細胞を選択的に選別することで、CBA/Caマウスの初期胚からES細胞株を分離することができました。

胚盤胞からES細胞株を得るための実証済みの標準技術は、初期胚を用いた実験技術に関する実験マニュアルに記載されています。実験用ES細胞株は、4.5日齢のマウス胚から単離したエピブラスト（一次外胚葉）を、かなり複雑な顕微手術技術と改良された培養条件を用いて培養することによっても得ることができます。この手順の労力は正当化されます。なぜなら、この場合、ES細胞株の形成頻度は、胚盤胞の内部細胞塊を用いた場合よりも大幅に高いことが示されたからです。

ES細胞株を分離するには、各クローンをマイクロウェルに移し、40～60個の細胞の集合体を増殖させ、その後再び分散させます。この手順を複数回繰り返すことで、プラスチックに付着した正核型の細胞の最大増殖率を持つ不死化ES細胞株を得ることができ、この細胞株は50～100回の継代後も全能性と高いテロメラーゼ活性を維持します。ES細胞株を維持するプロセスにおいて、最大の危険は培地または血清への細菌エンドトキシン汚染です。培地中に微量のエンドトキシンが存在するだけでも、未熟な生殖細胞の大量死を引き起こします。線形成長を注意深く監視し、適切なタイミングで分散させることで、培養中のES細胞は対称分裂が可能になり、両方の娘細胞が多能性を維持し、無制限の数の細胞周期を実行できるようになり、二倍体核型と全能性を維持します。

ヒトES細胞の純粋な集団の選択は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の合成をコードする遺伝子を含む組み換えDNA分子をES細胞のゲノムに導入することで行うことができます。ES細胞は増殖を促進する条件下で培養するとGFPの発現が増加しますが、分化が始まるとこの遺伝子の発現レベルは低下するため、選択培地上で純粋で安定した多能性細胞株を選択することができます。GFP選択法を用いて単離したES細胞を培養すると、分化細胞の強力な抗増殖作用が選択培養条件下では消失するため、コロニー形成頻度が数倍に増加します。

ヒト胚性幹細胞の細胞株への分化は、体外受精後に残存する着床前胚（細胞数80～120個）から分離する方法を用いて行われます。この目的のために、人工的に得られた「余剰」胚をデルベッコ・イーグル培地に機械的に分散させます。細胞を蛍光標識付き選択モノクローナル抗体で標識した後、胚芽細胞を分離します。胚芽細胞は、ディスパーゼ・コラーゲナーゼ混合物を用いて個々の細胞に分散させます。分散させた細胞は、最初の3継代培養の胚性線維芽細胞のフィーダー単層上に、特殊培地（80%デルベッコ培地＋20%ウシ胎児血清、500μg/ml IL-6、LIF、SCF含有）で培養します。この場合、幹細胞と前駆細胞の生存と増殖は、IL-6、LIF、およびSCFの作用によって維持されます。このような培地では、ES細胞は接着していない球状の細胞の懸濁クローンとして成長し、柔らかいピペッティングを繰り返して分離する必要があります。5～7日目に、懸濁培養物中に新しいクローンが現れます。ES細胞の最大成長率は、10～15個の細胞の段階でクローンを繰り返し分離することによって達成されます。その後、各クローンをマイクロウェルに移し、40～50個の細胞の集合体まで増殖させます。この手順を継代で何度も繰り返し、培養液を6cmディッシュあたり500万～1000万個の密度まで増加させます。トムソンはこのような継代培養法を用いて、ヒトES細胞の不死化クローンを10個単離した。これらのクローンは100回の継代培養後も高いテロメラーゼ活性、旺盛な増殖能、最小限の表現型特性、そして外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の350種の特殊細胞株のいずれにも分化する能力を完全に保持していた。ヒトES細胞の分化は（培地交換、血清の添加、LIFの除去により）細胞が基質に接着することから始まり、細胞骨格の形成と接着受容体の発現を示唆していた。重要なのは、無制限に増殖したにもかかわらず、ヒトES細胞は正常な核型を維持していたことである。

ヒトES細胞株を分離する2つ目の方法は、初代生殖細胞を用いる方法です。実験研究では、12.5日齢のマウス胚の生殖器官からE細胞株が得られることが示されています。しかし、この方法では、前駆細胞株の形成頻度は、それ以前の胚を用いた実験と比較して著しく低くなっています。また、妊娠13.5日のマウス胚の生殖腺から得られた初代生殖細胞は、全く細胞株へと分化することはできません。

多能性ヒトEG細胞の最初の安定した株は、5～9週齢の胚の生殖腺から単離された初代生殖腺細胞から得られました。単離された細胞は、メルカプトエタノール、フォルスコリン、および組み換えヒト成長因子（FGFおよびLIF）を添加した胎児血清を含むDMEM培地中で、不活化マウス胎児線維芽細胞を基質として培養されました。7～12日後、培養液中に多細胞コロニーが現れ、形態学的特徴および分子マーカーによってヒトEG細胞と一致しました。これらの細胞は凝集後、胚様体を形成し、さらに発達するにつれて、3つの胚葉すべての派生物を特徴とする分化細胞が出現しました。10～20回の継代培養を経ても、EG細胞株は正常な核型を維持し、多能性は失われませんでした。

LIF、膜結合型および可溶性のSteel因子、そしてTGF-βの複合作用が始原生殖細胞の発生プログラムを変化させることも示されています。始原生殖細胞は、有糸分裂を停止して卵形成または精子形成に向けて分化を開始する代わりに、増殖を続けます。さらに数回の有糸分裂周期を経て、胚盤葉上層細胞に類似した状態になり、生殖細胞前駆細胞の特性を失い、多能性胚性幹（EG）細胞へと転換します。

こうして1998年、ヒト胎児剖検組織の生殖原基から、不死化始原生殖細胞株が初めて単離された。ヒト胚発生において、始原生殖細胞は発生3週目に卵黄嚢に出現し、4～5週目に生殖結節部へ移行し、そこで休眠状態の一次生殖細胞集団を形成する。不活性状態の始原生殖細胞は、出生まで胚内に保存される。始原生殖細胞株は、5～9週齢の胚の胎児生殖結節から単離され、抽出された組織は、細胞の量的および質的収量を高めるために、コラーゲナーゼIV～V型、ヒアルロニダーゼ、およびDNaseの混合物で即時処理される。胎児生殖結節組織の始原生殖細胞は、間質（間葉系）セルトリ細胞に囲まれています。セルトリ細胞の機能的役割は、抗アポトーシス因子（Fasリガンド）、マイトジェン、免疫抑制剤を産生し、生殖細胞を体内の免疫攻撃から保護することです。さらに、生殖結節の間質性微小環境は配偶子の成熟において重要な役割を果たします。単離された初代生殖細胞は、最初の3継代の胎児線維芽細胞からなる支持間質層上に培養されます。最も効果的なマイトジェンの組み合わせは、LIF、FGF、およびフォルスコリン（cAMP形成の刺激因子）からなる複合体です。in vitroにおける初代生殖細胞の増殖には胎児血清の添加が必要であり、胎児血清の存在下では、培養中の初代生殖細胞の増殖に伴い、基質に付着していない球状細胞のクローンが形成されます。

米国国立衛生研究所では、胚盤胞からヒトES細胞株を分離する方法に関する既存データの要約に基づき、内部細胞塊が十分に形成された胚盤胞を培養するとES細胞の分離が成功する可能性が高いという予備的な結論が出されています（幹細胞：科学的進歩と将来の研究方向。米国国立衛生研究所）。この観点から、細胞株を作成するためのES細胞の最適な供給源は、発生5日目のヒト胚盤胞であり、内部細胞塊を分離する際には栄養外胚葉を慎重に除去する必要があります。この段階で30～35個の細胞からなる分離された内部細胞塊は、培養中にES細胞コロニーを形成するための決定的な条件である、マウス胎児線維芽細胞の基質上で培養する必要があります。

胚性幹細胞の表現型特性の解析

特に興味深いのは、ES細胞の表現型特性の種間比較分析です。ヒトES細胞のコロニーは扁平化した上皮様細胞の密集した塊であるのに対し、マウス胚様体は丸みを帯びた細胞の緩やかな集塊で構成されていることがわかりました。ヒトES細胞の核質比はマウスES細胞よりも低いです。サルの胚性幹細胞は、縁が不均一な扁平な細胞コロニーを形成します。霊長類ES細胞の初期クローンでは、個々の細胞を容易に観察できます。研究対象となったすべての動物種の増殖中のES細胞は、MHCクラスIおよびII分子を発現しません。同時に、ヒトES細胞はTERA 1-60抗体およびGCTM-2抗体に陽性反応を示し、これは胚性（奇形性）癌幹細胞の特徴であるケラチン/コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが表面に存在することを示しています。あらゆる動物種のES細胞におけるoct4遺伝子の発現は、表現型の違いはあるものの、多能性維持に関与する同一の遺伝子群がヒトおよびマウスES細胞において活性化されている可能性を示唆している（Peru, 2001）。さらに、ラット、ブタ、ウサギ、霊長類、ウシの胚から単離されたES細胞株は、類似した形態学的特徴、類似した分子識別マーカー群、そして胚発生プログラムを実行するためのほぼ同一の分子メカニズムを有しており、異種移植の問題を新たな視点から考察することが可能となる。

体内での通常の胚発生とは異なり、体外ES細胞の増殖は胚葉の形成を伴わず、恒常性Hoxgenesの阻害を背景に、すなわち器官形成なしに起こる。分節遺伝子が機能しないため、体節の形成、胚の分節化、卵黄嚢、尿膜、その他の暫定的な器官や組織の形成などの胚発生の期間をES細胞培養で再現することは不可能である。培養されたES細胞は、350の制限された特殊細胞株の形成プロセスの開始時に凍結しているように見える。したがって、娘祖細胞のクローンと中心に局在するES細胞は、胚のモデルにすぎず、その発生中に、共通の前駆細胞に由来する異なる組織領域で異なる特殊細胞株が同時に形成される。 ES細胞の表面にはごくわずかな受容体しか存在しないにもかかわらず、ES細胞は原始的な形態形成プロセスを実行する能力を保持しており、初期胚の体積構造を模倣しています。培養液中のES細胞の懸濁液は凝集体を形成し、胚盤胞、さらには後期胚（卵筒）に似た構造を形成します。このような懸濁液はそれぞれ単純胚様体と複雑胚様体と呼ばれます。

混合分化においては、外胚葉（oct3、fgf-5、nodal）、内胚葉（gata-4）、中胚葉（brachyury）、心臓中胚葉（pkh-2.5）、神経管（msx3）、造血（elkf）の初期遺伝子が、一つの胚様体中の異なる細胞で同時に発現します。in vitroにおける胚葉細胞の形成に標的を絞った作用を目的とした成長因子とサイトカインの様々な組み合わせを用いることで、外胚葉または中胚葉の遺伝子が優先的に発現する胚様体を得ることが多くの症例で可能となり、これにより原腸形成および器官形成の初期段階のモデル化への道が開かれました。

ES細胞のクローン増殖は非対称細胞分裂の証拠であり、クローンの中心にある1つのES細胞のみが無制限の増殖能を保持し、2番目の娘細胞はすでに分化中の前駆細胞の世代を生成します。したがって、胚様体の周辺部のクローン増殖率は中心よりも高くなります。成長中のクローンの辺縁細胞は、自発的に無秩序な分化を起こし、移動したり、アポトーシス機構によって死滅したりします。これらのイベントはクローンの運命を決定します。増殖率が移動とアポトーシスによる細胞死の速度を超えると、クローンはサイズを拡大し続け、アポトーシス速度と新しい細胞形成速度が等しくなると安定化が起こり、これらのプロセスの比率が逆になると退行が起こります。前駆細胞は対称的に分裂します。つまり、両方の娘細胞はその後、成熟した特殊細胞株に分化します。 ES細胞と前駆細胞の比率は変動しますが、ES細胞の数は前駆細胞集団のほんの一部にすぎません。したがって、慎重なピペッティングと適切なタイミングでのクローンの分離によってのみ、培養中のES細胞数を増やすことができます。10～12個の細胞の段階でクローンを分離することが、ES細胞の収量を最大化するのに最も効果的であることが判明しました。胚様体内の細胞の分化の方向と程度は、その場所によって異なります。胚様体の外側の細胞はoct4遺伝子を発現せず、一次内胚葉の細胞に分化し、そこからその後、壁側および臓側胚体外内胚葉の上皮様細胞が形成されます。胚様体の内部の細胞はoct4遺伝子を発現し、48時間の培養で多能性を維持します。しかし、培養物はその後、形態学的に上皮単層へと再構築され、一次外胚葉の発達を制御する遺伝子の発現が始まります。次に、3つの胚葉すべてから派生した様々な細胞型の出現を伴い、完全な無秩序な細胞分化のプロセスが始まります。胚様体細胞の自発的分化のプロセスでは、卵黄嚢の断片（嚢胞）の形で内胚葉マーカーを持つ凝集体が最初に出現します。次に、これらの構造物の中に血管芽細胞と成長中の毛細血管の内皮細胞が出現します。自発的分化の最終段階では、胚様体の内部細胞から、ニューロン、グリア細胞、心筋細胞、マクロファージ、赤血球など、様々な最終分化細胞が発生します。胚様体を用いることで、ある程度（胚組織層の形成の空間的反転を考慮すると）、体外での形態形成過程を研究し、胚細胞分化の初期段階の分子メカニズムを分析することが可能になる。これらのプロセスの実施における特定の遺伝子の役割を確立することも目的としています。

したがって、クローン内には、ES細胞、初期前駆細胞、分化前駆細胞集団など、異なる遺伝的発達プログラムが発見された細胞が存在します。ES細胞を、フィーダー層を使用せず、培地にLIFを添加しないハンギングドロップ法または大量培養法で培養すると、必然的に胚様体が形成されます。胚様体の外層と内層の細胞は形態が異なります。外層は大きな分岐細胞で構成されています。環境に面した表面は多数の微絨毛で覆われています。外層の細胞は、ライヒェルト膜に似た基底膜によって内層から隔てられていますが、胚様体の内層の細胞は円柱上皮です。形態学的には、内層には多くの分裂細胞が含まれていますが、ES細胞の未分化コロニーによく似ています。

ヒト胚性幹細胞の特徴

ホメオシス遺伝子阻害を背景とした実質-間葉系シグナル伝達相互作用の欠如は、培養下におけるES細胞の無秩序な成長を招き、仮臓器の基盤形成と発達を阻害します。培養下におけるES細胞の無秩序な成長と無秩序な自発的分化は、将来の臓器の間質性骨格における間葉系マーキングの欠如に起因します。in vitroでは数百万個の肝細胞を形成することは可能ですが、洞、ディッセ腔、クッファー細胞といった構造的・機能的要素を含む単一の肝小葉を得ることは不可能です。

ES細胞の多能性は、胚発生において胚の組織や器官の形成とともにのみ実現されると考えられており、胎盤と臍帯は栄養芽層の派生物です。栄養外胚葉膜に包まれたES細胞は、ノクテヨフの体積トポグラフィックマトリックスのコンビナトリアルmRNAを介して発達プログラムを実行する暫定細胞のクローンを次々に生成します。ノクテヨフの体積トポグラフィックマトリックスは、暫定器官と最終器官の空間配置、形状、サイズ、細胞数、そして実質を構造的・機能的単位に組み立てることを事前に決定します。同時に、ES細胞は、その多能性を実現するための分子メカニズムが遺伝的発達プログラムから完全に切り離されている唯一の細胞種であり、受容体認識とトランスシグナリングシステムの両方が阻害されているため、ES細胞自体は他の細胞と相互作用する能力を奪われています。しかし、ES細胞を適切に活性化することで、胚発生プログラムは段階的に発達し、最終的には数十億個の細胞からなる完全な生物が誕生し、子宮外での生活に備えることができます。細胞空間におけるこの短期的でありながら想像を絶するほど長い過程において、細胞の生命活動を保証する分子メカニズムと、細胞の増殖、分化、そして分化を制御するプログラムの両方において、必然的にエラーが発生します。そのため、現代の薬理ゲノム学では、分子構造の疾患と細胞プログラミングの疾患は別々に考察されます。さらに、ほとんどの新薬の作用は、分化、増殖、器官形成、そして臓器や組織の再生のプログラムを修正することを目的としています。成体生物において、ES細胞は、脳、肝臓、脾臓、骨髄などのヒト臓器に移植された幹細胞／前駆細胞の挙動を制御することを可能にし、保存された間葉系マトリックス上でドナー細胞を分化・分化させることで、レシピエント臓器の損傷した実質を修復します。本質的には、全能性プログラムは卵母細胞、接合子、割球のゲノムレベルで実現され始めますが、これらの細胞は、実験医療および実用医療のニーズに必要な量ではまだクローン化・継代培養されていません。したがって、ES細胞は、胚の3次元マップのコードと、胚葉形成期における特殊細胞株の線形制限コードを含む、他に類を見ない遺伝情報源であり続けています。

ES細胞のほぼ無限の再生能力は、分化した体細胞の遺伝子装置とは異なり、ES細胞のゲノムが多能性を保持していることに起因しています。ES細胞に埋め込まれた遺伝情報の休眠状態の現れの一つは、いわゆる最小表現型です。ES細胞の表面には限られた数の受容体が発現しており、それに伴い、細胞の核装置と微小環境との相互作用に用いられるトランスシグナリングプログラムもごくわずかしか機能していません。分化した細胞株の制限と細胞分化を担う遺伝子が冬眠状態にあるため、活性化される遺伝子は500個のうち約30個のみであり、その産物が細胞と周囲の微小環境との結合を保証しています。遺伝子発現の連続解析法を用いて、体細胞とES細胞におけるエネルギー代謝を調節するゲノムの主要機能ボックスが共通して機能する一方で、後者では受容体、Gタンパク質、二次メッセンジャー、転写酵素、発現および抑制補因子、すなわち細胞への調節シグナルの膜透過伝達システム全体のmRNAレベルが非常に低いことが示された。これは、トランスシグナリング遺伝子の発現が欠如しているか非常に低いことに起因している。ES細胞ゲノムの誘導分化期間中、細胞接着受容体、細胞外マトリックスの構成要素、制限転写酵素、および細胞膜受容体から核装置へのシグナル伝達システムのメッセンジャー要素の合成を制御する61のトランスシグナリング遺伝子の活性化を背景に、18の機能遺伝子が同時に機能を停止する。同時に、サイレンサータンパク質の合成を担う遺伝子の発現が阻害され、ESCゲノムの全能性を保証する遺伝子発現の共阻害因子も阻害されます。

3つの胚葉すべての細胞に遺伝子マーカーが見つかっています。外胚葉細胞層の識別は、nodal、oct3、fgf-5遺伝子の発現によって、中胚葉細胞層の識別はbrachyury、zeta-globin遺伝子の発現によって、内胚葉細胞の識別はgata-4遺伝子の発現によって行われます。正常な胚発生では、胚葉形成期に未熟な幹細胞および前駆細胞集団の活発な移動が観察され、頭蓋骨の顔面骨、脳の一部、末梢神経系、心臓伝導系、胸腺の発達領域が局所的にマークされます。これらの組織は、移動細胞のクローンから形成されます。胚葉の初期遺伝子による細胞のマーキングは、発生中の胚における前駆細胞の移動プロセスのトポグラフィック分析を容易にします。特に、P19胚性癌細胞の集合体において、最初の中胚葉遺伝子であるbrachyuryの発現は、組織プラスミノーゲン活性化因子、α-フェトプロテイン、ケラチン8、およびケラチン19の遺伝子の発現低下期に開始することが明らかにされています。これらの遺伝子は、最初に移動する中胚葉集団のマーカーです。したがって、中胚葉起源の組織の形成は、中胚葉前駆細胞の点移動と分散のプロセスが完了した後にのみ開始されます。

ES細胞は、表現型の特徴が極めて限定的であり、ほとんどのトランスシグナリングユニットが欠如しているにもかかわらず、識別に使用できるいくつかの受容体分子を発現しています。ヒトと霊長類のES細胞マーカー抗原が共通していることが判明したことは注目に値します。ES細胞の標識には、膜結合抗原SSEA-3、SSEA-4（糖脂質GL7とシアリン酸の複合体を表す固有の脂質抗原）、および高分子糖タンパク質TRA-1-81、TRA-1-60に対する標識抗体が最もよく使用されます。さらに、ES細胞は特異的胚抗原SSEA-1、内因性アルカリホスファターゼ、および特異的転写因子Oct4を発現します。後者はES細胞の増殖メカニズムを維持するために必要であり、特異的転写因子Oct4は線維芽細胞増殖因子4遺伝子の発現を活性化し、未熟細胞における無制限のDNA複製を担う遺伝子ボックスの発現を安定化させます。最も重要な細胞内マーカータンパク質は、クロマチンサイレンサータンパク質に関連する Oct3、Oct4、Tcf、および Groucho です。

体外でES細胞を培養する長年の試みが成功し、マウスの胚盤胞から単離された幹細胞と初代生殖細胞の培養が初めて得られた直後、ES細胞を初期発生段階の胚に導入することで、その多能性に関する研究が始まりました。桑実胚および胚盤胞の段階で、ES細胞はキメラ胚を形成できることが示され、キメラ胚においては、ドナーES細胞の子孫がすべての体細胞組織、さらには配偶子にも検出されました。このように、発生生物学において、ES細胞を用いることで、in vivoとin vitroの実験研究の間に「橋」が架けられ、一次組織および器官の形成過程、それらの分化、そして胚器官形成を研究する可能性が大幅に広がりました。

体内では、胚発生過程においてES細胞が初期胚の細胞塊に組み込まれ、その派生体があらゆる臓器や組織に存在することが明確に確立されています。ES細胞はキメラ胚において生殖細胞系列に定着し、その子孫が完全な卵子と精子を形成します。ES細胞はクローン形成能を有し、単一のES細胞から、oct4遺伝子およびアルカリホスファターゼの発現、高いテロメラーゼ活性、特定の胚抗原の発現といった分子マーカーを持つ、遺伝的に同一の細胞コロニーを形成することができます。

ES細胞を用いた胚発生のメカニズムを研究するため、外側に受容体の四倍体割球層を置き、その内側にドナーES細胞を導入する生物学的構造体を作製する、桑実胚キメラ化法が開発されました。こうして、受容体の四倍体割球の子孫から栄養芽層が形成され、着床と胎盤形成が保証されます。一方、ドナーES細胞は、生存可能な胚の体と一次生殖細胞系が形成される内部細胞塊として機能します。ES細胞の研究価値は、そのゲノムを用いたin vitro操作において多能性が維持されるだけでなく、キメラ胚の一次生殖細胞の形成に関与するES細胞の能力が維持される点にもあります。たった1つの遺伝子組み換えES細胞（ES細胞）の子孫が、この細胞を8細胞期胚と凝集または共培養して得られたキメラ胚のすべての一次胚葉および発達中の組織に分布することが示されている。緑色蛍光タンパク質遺伝子を導入したES細胞をマウスの桑実胚に移植すると、発達中の胚の研究対象となったすべての組織で、この細胞の蛍光子孫が見つかった（Shimada, 1999）。ES細胞を桑実胚に移植することで、ドナーES細胞の子孫のみで構成された生存可能なマウスを作製することができ、治療目的のクローン作成のさまざまな選択肢への展望が開かれる。この方法論的アプローチは現在、発生生物学の問題の研究に効果的に利用されており、特に、X染色体の遺伝子不活性化やES細胞のエピジェネティック不安定性のメカニズムの解析に利用されている。 ES細胞の初期胚への移植は、遺伝子治療実験だけでなく農業バイオテクノロジーでも使用されています。

遺伝子改変ES細胞の移植は、変異遺伝子の標的細胞を試験するために使用されます。体外培養されたES細胞は、バイオテクノロジーにおいてノックアウトマウスを作成するために使用されます。この目的で、研究対象の遺伝子は相同組換え（ノックアウト）によってES細胞から除去され、この遺伝子を欠失した細胞は選択培地上で単離されます。その後、ノックアウトES細胞は胚盤胞に導入されるか、桑実胚割球と凝集されます。このようにして得られたキメラ初期胚はレシピエントの雌に移植され、新生児マウスの中から特定の遺伝子について無接合の配偶子を持つ個体が選抜されます。この技術は、多くのノックアウトマウスの系統を作成するために使用されており、実験生物学および実験医学で広く使用されています。このような生物学的モデルは、胚発生における特定の遺伝子の重要性、およびヒトの疾患や病態のメカニズムにおけるそれらの役割を研究するために使用されています。さらに、ノックアウト動物系統は、新たな遺伝子治療法の前臨床試験にも用いられています。例えば、変異遺伝子の正常な対立遺伝子をES細胞ゲノムに導入することで、造血系に影響を与える変異を効果的に修正することが可能です。ES細胞への外来遺伝子の導入により、ホモ接合型トランスジェニック実験動物系統を迅速に作製することが可能になります。しかし、標的組換え遺伝子欠失技術は、これまでのところマウスES細胞においてのみ確実に開発されていることに留意する必要があります。ダブルノックアウトマウスES細胞を用いることで、7番染色体上の遺伝子クラスター領域（ヒト19番染色体上のゲノム領域のコピー）と11番染色体近位領域（ヒト5g染色体のコピー）の機能的役割が確立されました。マウスES細胞におけるこれらの遺伝子の欠失により、ヒトにおける類似遺伝子の機能を評価することが可能になりました。

ヒト胚発生遺伝子の機能研究の可能性は拡大しており、実験動物ES細胞ゲノムへの遺伝子導入により、特に、心臓中胚葉の形成と発達におけるcrypto遺伝子、眼胚発生におけるpax-6遺伝子の役割を解明することが可能となった。マウスの奇形癌および胚盤胞の未熟増殖ES細胞における最初の遺伝子発現マップが構築されつつあり、ES細胞におけるトランスシグナリング遺伝子の抑制が確認されている。60～80個の変異ES細胞と20～30個の正常着床前マウス胚細胞を組み合わせることで、ドナー細胞とレシピエント細胞からなる器官原基を持つキメラ胚が発生し、原腸陥入および器官形成における未知の遺伝子の役割を解明することが可能となった。発達中のマウス胚の遺伝子の機能マップには、副腎および生殖腺の形成における sf-1 遺伝子、腎臓の形成における wt-1 遺伝子、骨格筋の形成における myoD ファミリーの遺伝子、および赤血球生成およびリンパ球生成原基の制限成熟における gata-1-4 ファミリーの遺伝子の役割に関する情報が追加されました。

ベクターリコンビナーゼを用いたES細胞における母系および父系遺伝子の直接スイッチオフにより、胚発生初期における様々な遺伝子の機能が明らかになりました。また、未知のヒト遺伝子をマウスES細胞に誘導導入する技術は、重篤な遺伝病の発症に関与する新たな変異遺伝子の発見に貢献しています。ノックアウト法を用いて、胚組織の形成におけるいくつかの遺伝子の必須的意義が決定されました。gata-4（心筋）、gata-1（造血組織の赤血球系）、myoD（骨格筋）、brachyury（中胚葉）、制限転写酵素hnf3およびhnf4（肝幹細胞）、rag-2（Tリンパ球およびBリンパ球クローンの形成）が必須です（Repin, 2001）。 ES細胞における遺伝子の二重欠失は、生殖細胞遺伝子の機能的役割、分節化およびホメオシスの研究へのアクセスを開き、ES細胞移植は生存可能な種間雑種胚の取得を可能にしました。単一のドナーES細胞を8細胞期胚に移植するための改良された技術を用いて、受容者胚の多くの臓器の細胞レベルでのキメラ化の事実が証明されました。ヒト造血幹細胞を胚盤胞に導入した後、受容者マウスの臓器でヒト組織の細胞芽が発見されたことは注目すべきです。多能性ES細胞は、臓器形成期にマウス胚の血液中を循環することが確立されています。その生物学的機能は、将来の免疫系の胚組織化にある可能性があります。 ES細胞の助けを借りて、ヒトの遺伝病理の適切なモデルが実験室環境で再現されました。ジストロフィン遺伝子のダブルノックアウトはマウスのデュシェンヌ型筋ジストロフィーを、またATM遺伝子（クロマチンシグナルキナーゼ合成制御遺伝子）のノックアウトは毛細血管拡張性運動失調症をモデル化します。この致命的な小児遺伝性疾患では、DNA修復の欠陥により小脳のプルキンエ細胞の変性が進行し、増殖細胞の死に伴う胸腺の退縮が伴います。病理学的遺伝情報をES細胞に導入することでキメラマウスに再現された毛細血管拡張性運動失調症の臨床像、病態生理、病態形態は、ヒトのそれらと一致します。毛細血管拡張性運動失調症に加えて、ES細胞とノックアウトマウスを使用して、炭水化物と脂質の代謝、アミノ酸の異化、銅とビリルビンの排泄の病理に関連するいくつかの遺伝性ホモ接合性ヒト疾患の実験モデルが開発され、対応するヒト疾患を治療するための新しい方法の前臨床試験の段階で実験医学の可能性が大幅に拡大しました。

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幹細胞ハイブリッドの利用

ES細胞と体細胞を融合させたハイブリッド細胞は、幹細胞の多能性の研究や分化細胞の染色体リプログラミングに適した有望なモデルです。ES細胞と成体動物の分化細胞を融合させた細胞ハイブリッドは、異なる「年齢」のゲノム間の関係性を研究することを可能にします。異なる分化段階や成熟度の細胞に由来する相同染色体が同一の核内に存在するという特異な状況が生じ、そこではトランスアクティング制御シグナルを容易に交換することができます。個体発生中に形成される相同染色体のシス制御性エピジェネティックシステムが、胚関連ゲノムから発せられるトランスアクティングシグナルの影響にどのように反応するかを予測することは困難です。さらに、ハイブリッド細胞では親の染色体の分離が起こるため、個々の染色体レベルでゲノムの相互作用を研究することが可能となり、多能性の維持における特定の染色体の関与や、逆に分化への出口を特定できる可能性があります。

多能性奇形癌細胞と分化体細胞を融合させた細胞ハイブリッドは、異なる「発生履歴」を持つゲノムの相互作用を研究するための最初の実験モデルとして用いられた。場合によっては、このようなハイブリッド細胞はかなり高いレベルで多能性特性を保持していた。特に、生体内では奇形癌細胞と体細胞のハイブリッド細胞は、3つの胚葉すべての派生体を含む真の奇形腫の発生を誘導し、生体外での懸濁培養では胚様体を形成した。この種の種間細胞ハイブリッドにおいても、奇形癌細胞との融合における体細胞パートナーがリンパ球または胸腺細胞であった場合、胚抗原の存在が認められた。奇形癌細胞と線維芽細胞を融合させた細胞ハイブリッドが、線維芽細胞の表現型と一致していたことは注目に値する。

最も重要な事実は、テラトカルシノーマ-体細胞雑種細胞において、分化細胞ゲノムの再プログラミングの兆候が認められ、体細胞パートナーの個々の遺伝子または不活性X染色体の再活性化を特徴とする点である。したがって、テラトカルシノーマ-体細胞型の細胞雑種に関する研究結果は、雑種細胞において多能性がしばしば保持され、体細胞パートナーのゲノムの再プログラミングの兆候が認められることを示唆している。

マウスES細胞と成体脾臓細胞を融合させて種内胚性雑種細胞を得る実験において、このような細胞雑種細胞の特性を研究し、親細胞の染色体の分離を解析し、雑種ゲノムの多能性を評価しました。奇形癌細胞と体細胞を融合させて得られた種内雑種細胞は、通常、染色体分離レベルが低く、四倍体または四倍体に近い核型を呈します。同様の染色体構成は、初代生殖細胞とリンパ球を融合させた細胞雑種細胞でも観察されました。一方、マウス奇形癌細胞とミンクリンパ球を融合させて得られた種間雑種細胞は、体細胞パートナーの染色体の強い分離を示しました。

ポリメラーゼ連鎖反応を使用してマイクロサテライトを分析する方法が開発された後、種内雑種における親の染色体の分離の研究において質的に新しい段階が始まりました。これにより、マウスの染色体ごとに数百のマーカーが見つかり、雑種細胞内の相同染色体の任意のペアを確実に区別できるようになりました。

ES細胞（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性欠損HM-1細胞、2n = 40、XY、129/01aマウスの胚盤胞から分離）を同系DD/cマウスの脾細胞と融合させることで、ES細胞と形態的に類似したハイブリッドクローンのセットを得ることができました。すべてのクローンは、活性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを持つ細胞のみが成長できる選択培地で分離されました。電気泳動分析の結果、すべてのクローンがDD/cマウスに特徴的なヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの対立遺伝子変異体を持っていることが示されました。細胞遺伝学的分析の結果、4つのハイブリッドクローンのうち3つが近似二倍体の染色体セットを持っていることが示されました。1つの近似四倍体クローンには2つのハイブリッド細胞集団が含まれており、そのうちの1つは四倍体で、もう1つの小さい方は二倍体でした。

マイクロサテライト解析は、マウス129/01aおよびDD/cの相同染色体の任意のペアを判別することを可能にするもので、近似二倍体セットを持つ雑種クローンにおいて、2つのクローンにおいて体細胞パートナーの常染色体が明確に優先的に除去されていることが示された。クローンHESS2およびHESS3のほとんどの常染色体には、多能性パートナーである129/01a系統のマーカーが含まれていた。例外は1番染色体とI番染色体であった。クローンHESS2およびHESS3には、HM-1細胞のマーカーとともに、体細胞パートナーのマーカーが少量存在していた。このような結果は、体細胞パートナーの1番染色体とI番染色体の不完全な分離を反映している可能性があり、これらの染色体のトリソミーがクローンHESS2およびHESS3の細胞の30～40%で観察されるという細胞遺伝学的データと一致している。クローンHESS4は染色体構成において顕著な違いを示しました。このクローンの多くの常染色体はES細胞ゲノム（2、3、4、5、6、7、10、13、14、17番染色体）に由来していましたが、1、9、11、12、15、16、18、19番染色体は両親の相同染色体によって構成されていました。これらの相同染色体を示すマイクロサテライトの定量比はおよそ1:1でした。このことから、著者らは一方の相同染色体がES細胞ゲノムに由来し、もう一方の相同染色体が分化細胞に由来すると推定しました。クローンHESS4の一部のサブクローンでは、体細胞パートナーの18番染色体と19番染色体のマーカーのみが存在していました。得られた結果は、HESS4 クローンの細胞では、体細胞パートナーの染色体の分離に加えて、多能性ゲノムの上記染色体の相同体の 1 つまたは両方が除去されたこと、つまり両親の染色体の両側分離があったことを示しています。これは、親の 1 つだけの染色体の分離が細胞ハイブリッドの特徴であるため、非常に珍しい現象です。

さらに、20回目の継代以降、ハイブリッド細胞のすべてのクローンには体細胞パートナーのX染色体のマーカーのみが含まれていました。つまり、クローンではES細胞のX染色体が体細胞パートナーのX染色体に置き換えられていました。この重要な事実は、マウスX染色体に特異的なFITC標識プローブを用いたin situハイブリダイゼーションデータによって確認されました。陽性シグナルは1つの染色体でのみ検出されました。培養の初期段階（15回目の継代以前）では、細胞遺伝学的データによると、多くの細胞に2つのX染色体が含まれていたことに留意する必要があります。したがって、選択培地を使用することで、ハイブリッド細胞の染色体構成を操作し、ES細胞のゲノムを背景に体細胞パートナーの単一の染色体を含むクローンを選択的に選択することが可能になります。

細胞ハイブリッドゲノムのユニークな特徴は、親ゲノムが一つの核に局在することであるため、分化細胞のゲノムと密接に接触した条件下で、ES細胞-体細胞ハイブリッドにおける胚ゲノムの多能性特性がどの程度保持されるのかという疑問が当然生じる。形態学的には、ES細胞と体細胞の細胞ハイブリッドは親ES細胞株と類似していた。多能性の評価により、ほぼ二倍体の染色体セットを持つすべてのクローンが、3つの胚葉由来物が存在する懸濁培養において胚様体を形成する能力があることが示された。

ほとんどのハイブリッド細胞は、マウス初期胚の特徴マーカーであるECMA-7抗原を含み、また高いアルカリホスファターゼ活性を示しました。ハイブリッド細胞の高い多能性に関する最も説得力のあるデータは、HESS2クローンのハイブリッド細胞を用いた一連の注入キメラの取得実験において得られました。生化学的マーカーの分析により、ドナーハイブリッド細胞の子孫がキメラのほとんどの組織に存在することが示されました。したがって、ES細胞と体細胞分化細胞を融合して得られたハイブリッド細胞は、胚盤胞腔に注入された際にキメラを形成する能力を含め、高いレベルの多能性を保持しています。

クローンHESS2とHESS4は、親染色体の構成が大きく異なっていましたが、多能性に関しては類似していました。雑種ゲノムにおける多能性は優性形質として発現すると考えられますが、胚ゲノムのすべての染色体が多能性維持に関与しているわけではない可能性があります。この仮定が正しいとすれば、多能性パートナーの染色体の一部を雑種細胞のゲノムから除去しても、多能性状態の変化は伴わないことが予想されます。この場合、胚性雑種細胞における親染色体の分離を解析することで、胚細胞の多能性制御を担う染色体の特定に近づくことができると考えられます。

O. Serov et al. (2001) は、129/01aマウスの遺伝子型を持ちDDマウスのX染色体を持つ正常マウスとキメラを交配して得られた50匹の子孫の中に、子孫が1匹もいなかったと報告している。著者らは、これは体細胞ゲノムの影響下で雑種細胞における多能性が低下するためだと考えている。別の説明としては、一部の常染色体に対するトリソミーの悪影響と、減数分裂中の雑種細胞における性染色体の不均衡（15代目の細胞までXXYが観察された）が考えられる。XXY細胞は減数分裂できず、配偶子を形成できないことが知られている。トリソミーは雑種細胞の増殖活性の低下も引き起こす可能性があり、その結果、キメラの発生における選択的優位性は受容胚の細胞に属する可能性がある。したがって、ハイブリッド細胞の多能性を適切に評価するには、正常な二倍体の染色体セットを持つハイブリッドクローンを入手する必要がある。

O. セロフら（2001年）の実験において、体細胞のX染色体を雑種細胞のゲノム内で再プログラム化できることが初めて実証されました。著者らのこの結論は、キメラにおけるhprt遺伝子（X染色体マーカー）の発現解析から導き出されたものです。解析した全てのキメラ組織において、DD/cマウスのhprt遺伝子の対立遺伝子変異体の存在が検出されました。ここで強調しておきたいのは、雑種細胞を胚盤胞腔に導入すると、細胞ハイブリッドは非選択的状態となり、雑種細胞のゲノム内でX染色体が保存されるということは、X染色体がその必須構成要素となり、ゲノムが多能性パートナーのY染色体と区別しないことを意味するということです。

ハイブリッド胚細胞における体細胞ゲノムと多能性ゲノムの相互作用解析の結果をまとめ、著者らは、一部の細胞ハイブリッドにおいて多能性が優性形質として発現していると結論付けています。ハイブリッドゲノムは分化細胞の個々の染色体を再プログラム化することができますが、体細胞ゲノムが胚ゲノムの多能性に逆効果を及ぼす可能性も否定できません。ハイブリッド細胞を培養すると、ES細胞（HM-1）の元の親株と比較して、分化誘導が著しく頻繁に起こります。同様の効果が一次コロニー形成時にも観察されます。胚性ハイブリッド細胞の一次コロニーの多くは、形成初期に分化し、淘汰と増殖の過程でクローンの大きな損失が発生します。

このように、ES細胞と体細胞の融合によって作製された細胞ハイブリッドは、分化細胞のゲノムと密接に接触しているにもかかわらず、胚ゲノム特有の特性である多能性を保持している。さらに、このようなハイブリッド細胞では、分化細胞由来の個々の染色体の再プログラム化が可能である。胚ゲノムの多能性特性がハイブリッド細胞においてどの程度保持されるか、特にキメラにおける生殖系列形成に関与する能力は不明である。そのためには、正常な核型を持つ胚ハイブリッド細胞を得る必要がある。いずれにせよ、多能性胚ハイブリッド細胞は、親の染色体の両側分離がそのような機会を提供する可能性があるため、多能性の維持または制御に関与する染色体を同定するための真の遺伝子モデルとなり得る。

O. Serovら（2001）が「染色体記憶」と定義した現象の研究も同様に興味深い。ハイブリッドゲノムにおいて、相同染色体は2つの代替構成をとる。体細胞パートナーの相同染色体は既に分化しているが、多能性パートナーの相同染色体では分化プロセスが始まったばかりである。したがって、ハイブリッド細胞が高い多能性特性を維持していることは、体細胞パートナーから発生するトランスアクティング因子の影響にもかかわらず、ES細胞相同染色体の「多能性」構成がハイブリッドゲノムにおいて十分に安定していることを示す。キメラ発生中に分化ゲノムの相同染色体がリプログラミングされる上記の兆候は、in vitroにおける細胞ハイブリッドの形成および培養の初期段階において、in vivoでの分化中に獲得した状態が保持される可能性を排除するものではない。最近得られたデータによると、胚性雑種細胞を非選択的環境に移すと、体細胞パートナーの染色体のみが集中的に除去されることが示されました。つまり、雑種細胞のゲノムは、in vitro培養で10～15回の継代培養後、相同遺伝子を容易に識別できるということです。したがって、胚性雑種細胞は、多能性といった胚ゲノムの基本的な特性だけでなく、その代替特性である胚分化についても研究するための有望な実験モデルとなります。

胚性幹細胞移植の治療効果

ES細胞およびその誘導体の移植による治療効果を分析する前に、上記の内容を要約します。ES細胞は、体外胚発生を完全に実現する能力が不十分です。この場合、ES細胞とは独立して体内で自律的に発生する間葉系幹細胞が欠如しているため、発生異常が起こります。ES細胞の遺伝的ポテンシャルは接合子の遺伝的ポテンシャルよりも低いため、ES細胞はクローン胚に直接使用されません。ES細胞は、発生プログラムが一貫した方法で完全に展開される唯一の細胞であり、その独自の生物学的ポテンシャルは遺伝子機能研究に活用されています。ES細胞を用いることで、三胚葉の発生をコードする初期遺伝子と後期遺伝子の発現を活性化する最初のシグナルの組み合わせが解読されます。ES細胞ゲノムの多能性は体外でも維持されるため、ES細胞は修復再生のための独自のツールとなり、臓器や組織が損傷した際に細胞の損失を自動的に補充することができます。理想的な仮説のシナリオでは、「ドナー ES 細胞を移植すると、コンパクトにまとめられたプログラムがレシピエントの体に移され、好ましい条件下では新しい組織の構築で実現され、形態学的および機能的レベルの両方でレシピエントの体に効果的に統合される」7 と想定できます。

ES細胞の単一分化法の開発に伴い、当然のことながら、単一の特殊化クローンからin vitroで得られた細胞の機能活性に関するin vivo研究が始まりました。増殖するES細胞クローンは、移植患者の組織損傷部位に能動的に統合する能力を持つ遊走性前駆細胞集団を生成し、これは再生医療に用いられます。黒質へのDOPAニューロン移植は、実験的片側パーキンソン病の臨床症状を軽減することが実証されています。ドナー神経幹細胞の局所移植は、脊髄および脳の外傷または挫傷によって引き起こされる運動障害の程度を軽減します。脱髄疾患における幹細胞移植の最初の良好な結果も得られています。ES細胞の再生可塑性ポテンシャルは、実医療における細胞移植の応用に無限の可能性を開くと思われます。しかしながら、異所性領域に移植されたES細胞は、必然的に腫瘍へと変化します。奇形腫は、免疫不全マウスにES細胞を皮下注射することで形成される。ES細胞懸濁液を同系マウスの精巣被膜下に移植した場合も、三胚葉全てに由来する細胞からなる異なる組織からなる奇形腫が形成される。このような奇形腫では、器官形成の減少は極めてまれである。

多くの研究により、実験病理を有する動物への初期ES細胞由来細胞の移植による良好な結果に関する情報が得られています。ES細胞由来細胞を用いた細胞神経移植は、脳および脊髄損傷における機能障害の矯正、脊髄空洞症および多発性硬化症の治療を目的とした実験および最初の臨床試験において、さらに発展を遂げています（Repin, 2001）。ES細胞からのin vitro神経新生技術の登場により、胚性脳組織の代わりに、胚性神経組織培養から得られた神経球由来細胞を移植する方法が開発されています。このような移植懸濁液は、より均質性が高く、ニューロンおよび神経膠細胞の分化前駆細胞を含んでいます。

培養液にレチノイン酸を10 μg/mlの用量で6週間定期的に添加すると、ヒト胎児（奇形）癌細胞株NTERA-2で80%を超える有糸分裂終了ニューロンが形成される。免疫表現型マーカーで標識された成熟ニューロンのフローソーティングにより、ニューロン集団の完全な均質性が達成され、これにより、奇形癌細胞と未熟細胞の残留物を除去することができる。実験動物の脳のさまざまな領域に移植された後、このようなニューロンは生き残るだけでなく、局所神経ネットワークに統合される。局所的中枢神経系欠陥の実験モデルを持つ動物では、神経移植により、外傷性脳損傷、脳卒中、脱髄疾患、小脳発達の遺伝的欠陥、脂質および多糖類沈着の疾患などのヒト病理の臨床症状が軽減される。

中枢神経系の変性疾患における再生プロセスを最適化するため、ES細胞からミエリン産生オリゴデンドロサイトを得る技術が開発されています。第一段階では、従来通り、ES細胞の増殖と移植に必要な細胞数の増殖が行われます。第二段階では、選択マーカー抗原によって制御された、ミエリン産生オリゴデンドロサイト前駆細胞集団への細胞分化が行われます。

胸腺成熟における遺伝的欠陥によって引き起こされる免疫不全を治療する方法の開発において、ES細胞誘導体の利用に一定の展望が開かれています。TCR遺伝子のV(D)J遺伝子座の組換え機構の破壊（Tリンパ球機能の喪失につながる）を誘導した遺伝子欠陥を持つノックアウトマウス（RAG1）を用いた研究では、動物の胸腺に初期ES細胞誘導体を移植することで、細胞性免疫を担う正常な免疫クローン集団の成熟が回復することが示されています。小児の致死性遺伝性貧血の治療を目的とした、体外培養済みES細胞移植の臨床試験が進行中です。

幹細胞移植の臨床への急速な導入に対する反対意見は、ヒト胚性幹細胞の安定した細胞株の数が限られていること、そしてそれらの標準化の必要性に基づいています。標準化されたES細胞株および成人ヒト幹細胞の純度を高めるために、短いタンデムDNAリピートの分子遺伝学的解析に基づく細胞株選択法を用いることが提案されています。また、細胞培養条件下で発生する可能性が非常に高い、小さな染色体再編成や遺伝子変異の有無についてES細胞株を検査することも必要です。ES細胞および局所多能性幹細胞は、in vitroでの増殖によって、胚性幹細胞や確定組織には本来備わっていない新たな特性が発現する可能性があるため、あらゆる種類のES細胞および局所多能性幹細胞の特性を必須に検査する必要があるという主張が提起されています。特に、サイトカインを含む培地で長期培養すると、ES細胞株は腫瘍細胞に近づくと考えられています。なぜなら、ES細胞株は細胞周期制御経路において腫瘍細胞と同様の変化を起こし、無制限の細胞分裂を行う能力を獲得するからです。一部の研究者は、腫瘍発生の可能性を理由に、初期胚性幹細胞由来細胞をヒトに移植することは無謀だと考えています。彼らの意見では、分化誘導されたES細胞の子孫、すなわち分化細胞前駆細胞の株を使用する方がはるかに安全です。しかしながら、現時点では、望ましい方向に分化する安定したヒト細胞株を得るための信頼性の高い技術はまだ開発されていません。

このように、ヒト胚性幹細胞由来細胞の移植による治療効果に関するデータが文献にますます多く掲載されています。しかしながら、これらの研究の多くは再検討され、批判されています。初期の臨床試験の結果は予備的なものであり、幹細胞が特定の疾患の臨床経過に好ましい効果を発揮できることを示しているに過ぎないと考える研究者もいます。そのため、細胞移植の遠隔的結果に関するデータを取得することが必要です。臨床神経移植学の発展段階が議論の的となっています。実際、当初はパーキンソン病における胚性脳片の移植の高い有効性に関する論文が文献で優勢でしたが、その後、患者の脳に移植された胚性または胎児性神経組織の治療効果を否定する報告が出始めました。

最初の臨床試験は、NTERA-2奇形癌ES細胞由来の神経芽細胞の移植安全性を評価するために実施されました。これらの未熟細胞は培養下で1億個の細胞塊が蓄積するまで増殖させられました。このようにして得られた細胞の一部は、表現型の特徴付け、細胞不純物の特定、およびウイルスや細菌による汚染の可能性の検査に使用されました。LIFと胎児間質細胞のフィーダー層は培養液から除去され、サイトカインと成長因子の組み合わせを用いてES細胞から神経芽細胞への分化を誘導するための条件が整えられました。その後、フローセルソーターを用いて未熟奇形癌細胞から神経芽細胞が精製されました。移植細胞の二次精製と表現型の特徴付けの後、脳卒中後7ヶ月目に、特殊なマイクロカニューレと注射器を用いて、定位固定装置とコンピューター断層撮影装置による監視下で、神経芽細胞（1,000万～1,200万個）の懸濁液を患者の脳の基底核に注入しました（出血性脳卒中後7ヶ月目）。移植後1年間、脳卒中部位へのニューロン移植の結果についてスクリーニングを実施しましたが、副作用や望ましくない影響は認められませんでした。患者の半数は、移植後6ヶ月から12ヶ月の間に運動機能の改善を示しました。細胞移植後の脳卒中部位への血液供給の増加は、臨床的に好ましい変化を伴い、陽電子放出断層撮影法によると、蛍光標識2-デオキシグルコースの吸収は平均18%増加し、患者によっては35%増加しました。

しかし、米国国立衛生研究所は、パーキンソン病患者における神経移植の臨床的有効性に関する独自の研究を実施しました。第一群の患者にはドーパミンを産生する胎児神経組織片が移植され、第二群の患者には偽手術が行われました。その結果、ドーパミンを産生する胎児神経細胞がレシピエントの脳内で生存していたにもかかわらず、このような神経移植の臨床的有効性はゼロであることが示されました。さらに、胎児神経組織移植から2年後、患者の15%に持続性ジスキネジアが発現しましたが、プラセボ群の患者にはこの症状は認められませんでした（「幹細胞：科学的進歩と将来の研究方向」、米国国立衛生研究所）。これらの患者における疾患のさらなる進行については、現在も観察が続けられています。

一部の著者は、神経移植の臨床的有効性の評価に関する矛盾した文献データを、患者グループの選択に対する異なるアプローチ、患者の状態を客観的に評価する方法の不適切な選択、そして最も重要な点として、胎児神経組織の発達期間の違い、この組織が採取された脳の異なる領域、移植のサイズの違い、および外科的介入の方法論的特徴に関連付けています。

実験的片側パーキンソン病を呈したラットの脳線条体領域への多能性胚性幹細胞の直接移植の試みは、ES細胞の増殖とドーパミン作動性ニューロンへの分化を伴っていたことに注目すべきである。ES細胞移植後、アポモルフィン試験における行動異常および運動非対称性の修正が観察されたことから、新たに形成されたニューロンは神経ネットワークに効果的に統合されたと考えられる。同時に、移植されたES細胞が脳腫瘍へと変化したために死亡した動物もいた。

米国国立医学アカデミーの専門家、米国国立衛生研究所の専門家は、ES細胞の臨床的可能性は最も真剣に検討する価値があると考えていますが、ヒト疾患の適切な生物学的モデルを用いた実験において、ES細胞の特性、合併症の可能性、および長期的影響について詳細な研究を行う必要があると主張しています（幹細胞と将来の再生医療、米国アカデミー出版、幹細胞と将来の研究の方向性、米国国立衛生研究所）。

この観点から、ES細胞懸濁液を精巣に移植して得られた実験的奇形腫と、同じくES細胞を含む初期胚の移植によって形成された奇形腫とを比較した組織学的解析により、ES細胞は、その起源や特定の周辺細胞との相互作用にかかわらず、同じように腫瘍形成能を発揮することが示されたことは重要です。このような奇形腫はクローン起源であることが証明されており、3つの胚葉すべての派生物からなる腫瘍が1つのES細胞から発生する可能性があります（Rega、2001）。注目すべきは、正常核型のクローンES細胞を免疫不全マウスに移植した場合、異なるタイプの分化体細胞からなる奇形腫も形成されたことです。これらの実験データは、奇形腫のクローン起源の完璧な証拠です。発生生物学の観点から見ると、これらの研究は、複数の分化誘導前駆細胞ではなく、単一の多能性幹細胞が、奇形腫を構成する3つの胚葉すべての分化誘導物の供給源として機能することを示しています。しかし、実用的な細胞移植への道のりにおいて、これらの研究結果は、禁止事項とまではいかないまでも、潜在的な危険の警告サインです。なぜなら、成体免疫不全マウスのさまざまな組織にES細胞または始原生殖細胞を接種すると、移植された幹細胞から腫瘍が発生することが避けられないからです。異所性移植されたES細胞の腫瘍性変性は、ES細胞と前駆クローンが特殊な細胞株に部分的に分化することにより、分化細胞のサテライト集団の出現を伴います。興味深いことに、ES細胞を骨格筋に移植すると、ニューロンはほとんどの場合、奇形癌細胞の隣に形成されます。しかし、分裂中の卵子または胚盤胞へのES細胞の導入は、腫瘍性要素の形成なしに細胞が胚に完全に統合されるというプロセスを伴います。この場合、ES細胞は生殖原基を含む胚のほぼすべての器官および組織に統合されます。このようなアロフェン動物は、8～100細胞期の初期胚にテラトカルシノーマ129細胞を導入することによって初めて得られました。アロフェンマウスでは、ドナーES細胞由来の異種細胞集団が骨髄、腸、皮膚、肝臓、生殖器の組織に統合されるため、実験において種間細胞キメラを作成することさえ可能です。初期胚の発生期間が短いほど、細胞キメラ化率が高くなり、アロフェン胚の造血系、皮膚、神経系、肝臓、小腸で最も高いキメラ化度が観察されました。成体生物では、組織血球バリアによって受容体の免疫系から保護されている組織がキメラ化の影響を受けやすい。一次生殖細胞を精巣実質に移植すると、ドナー幹細胞がレシピエントの胚組織層に取り込まれます。しかし、ES細胞を胚盤胞に移植した場合、ドナー一次生殖細胞の生成に伴う生殖器のキメラ原基の形成は起こりません。ES細胞の多能性は、特別な条件が整えばクローン作製にも利用できます。例えば、サイトカルシンによって細胞分裂が阻害された8～16細胞期のマウス胚にマウスES細胞を移植すると、ドナーES細胞から胚が発育し、正常な胚発生が促進されます。

したがって、同種ES細胞移植の代替手段として、体細胞核を除核卵子に移植して胚盤胞を作製し、その内部細胞塊から体細胞核の提供者と遺伝的に同一のES細胞株を単離する治療的クローニングが考えられます。技術的には、このアイデアは十分に実現可能です。体細胞核を除核卵子に移植して得られた胚盤胞からES細胞株を作製できることは、実験動物実験において繰り返し実証されているからです（Nagy, 1990; Munsie, 2000）。特に、rag2遺伝子変異のホモ接合型マウスにおいて、表皮下組織細胞を培養して得られた線維芽細胞を核の提供者として用い、除核卵母細胞に移植しました。卵母細胞を活性化した後、「接合子」を胚盤胞形成まで培養し、その内部細胞塊からES細胞を単離し、変異遺伝子（rag2~/~）を欠損した細胞株に移植した。これらのES細胞では、相同組換え法により、一方の対立遺伝子の変異が修正された。最初の一連の実験では、組換え修復遺伝子を持つES細胞から胚様体を得て、その細胞に組換えレトロウイルス（HoxB4i/GFP）を導入し、生殖後にrag2~/~マウスの静脈に注入した。第2の一連の実験では、四倍体割球を遺伝子改変ES細胞で凝集させ、レシピエントの雌に移植した。得られた免疫能のあるマウスは、rag2~/~変異マウスへの移植のための骨髄ドナーとして利用された。どちらの研究でも結果は良好で、3～4週間後、全てのマウスにおいて免疫グロブリンを産生できる成熟した正常な骨髄細胞およびリンパ球細胞が認められました。このように、体細胞核を卵母細胞に移植することは、ES細胞株を得るためだけでなく、細胞遺伝学的治療（ES細胞を遺伝子情報の輸送ベクターとして用いる遺伝性異常の修正）にも応用可能です。しかし、この細胞移植の方向性には、生命倫理上の問題に加えて、限界があります。特定の患者の遺伝子型と同一の遺伝子型を持つ治療目的のクローン細胞を移植することの安全性は不明です。なぜなら、このような細胞は他の疾患の素因となる変異を導入する可能性があるからです。正常なヒトの卵子は依然として入手が困難な対象であり、体細胞核を除核した動物の卵子に移植した場合でも、作製された「接合子」のうち胚盤胞期まで発達するのはわずか15～25%に過ぎません。多能性クローンES細胞1系統を得るために必要な胚盤胞の数は、まだ確定していません。また、治療目的のクローン技術の複雑さに伴う高額な費用も注目に値します。

結論として、ES細胞では、低メチル化DNAを含むゲノムの多能性が、高いテロメラーゼ活性および細胞周期の短いC^期と組み合わされ、集中的で潜在的に無限の複製を保証し、その間、ES細胞は二倍体の染色体セットと「幼若」な表現型特性セットを保持することに留意すべきである。培養中のES細胞のクローン成長は、増殖を停止し、適切な調節シグナルを加えると、生物のどの特殊細胞株への分化も妨げない。ES細胞の体細胞株へのin vitro制限分化は、間葉系の参加なしに、ノクテイを迂回して、器官形成外で、胚形成なしに実現される。ES細胞のin vivo異所性導入は、必然的に奇形癌の形成につながる。 ES細胞を胚盤胞または初期胚に移植すると、ES細胞は胚組織と統合され、その臓器は安定したキメラ化を起こします。

細胞移植に基づく再生医療技術は、細胞生物学、発生生物学、実験遺伝学、免疫学、神経学、心臓学、血液学など、実験医学および実医学の多くの分野の代表者の関心が交わる点です。実験研究の最も重要な成果は、幹細胞の特性を標的に応じて変化させることで幹細胞をリプログラミングすることが可能であることを示しており、これは成長因子を用いた細胞分化プロセスの制御、すなわち心筋再生、中枢神経系病変の修復、膵島機能の正常化への可能性を切り開きます。しかし、ES細胞由来細胞の移植を実医学に広く導入するには、ヒト幹細胞の特性をより詳細に研究し、実験的疾患モデルにおけるES細胞を用いた実験を継続する必要があります。

成体生物の局所幹細胞ゲノムの可塑性の発見により、生命倫理上の問題と同種細胞移植の拒絶反応の問題は解決される可能性がある。しかしながら、単離され、綿密に特徴付けられた造血自己細胞を肝臓に移植すると、そこから新たな肝細胞が誘導され、肝小葉に統合するという当初の情報は現在修正され、批判されている。一方で、胸腺への神経幹細胞の移植は新たなドナーTリンパ球およびBリンパ球の芽形成を引き起こし、骨髄への脳神経幹細胞の移植は長期にわたるドナー骨髄および赤血球造血を伴う造血芽形成につながるというデータが発表されている。その結果、ゲノムをES細胞の潜在能力に再プログラムできる多能性幹細胞は、成体生物の臓器内に残存することができる。

医療目的でES細胞を得るための源は依然としてヒト胚であり、これは人命の起源において、道徳、倫理、法的、そして宗教的な諸問題が新たに交差する必然性を決定づけるものである。ES細胞の発見は、生細胞と物質、存在と人格の境界線をめぐる厳しい議論の再開に強力な弾みを与えた。同時に、ES細胞の医療利用に関する普遍的な規範、規則、法律は、幾度となく制定・導入の試みがなされてきたにもかかわらず、未だ存在していない。各国は、それぞれの法律の枠組みの中で、この問題を独自に解決している。一方、世界中の医師たちは、主に胚性幹細胞ではなく成体幹細胞の蓄積を用いることで、再生医療をこうした議論の枠を超えようと試み続けている。

胚性幹細胞の分離の歴史

129/ter-Svマウスの自然発生精巣奇形腫、Lt/Svマウスの自然発生卵巣奇形腫、および異所性移植された胚細胞または組織由来の奇形腫から、奇形（胎児）癌細胞が単離された。このようにして得られた安定したマウス奇形（胎児）癌細胞株の中には、多能性を示すもの、特定の細胞型にのみ分化するもの、そして全く細胞分化能を持たないものなどがあった。

かつては、発育中の胎児の組織に導入された後に奇形（胎児）癌細胞を正常な表現型に戻す可能性を示唆する研究や、ヒトの遺伝病理の生物学的モデル化のために突然変異マウスを得るための遺伝子組み換え奇形（胎児）癌細胞の試験管内作成に関する研究に焦点が当てられていました。

培養液培養は、奇形（胚）癌細胞株の分離に用いられた。培養において、奇形（胚）癌細胞はES細胞と同様に胚様体を形成し、細胞株の移植には分離が必要となる。胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上、または培養液中での培養において、多能性は維持される。多能性奇形（胚）癌細胞株の細胞は大型で球状であり、高いアルカリホスファターゼ活性を特徴とし、凝集体を形成し、多方向への分化が可能である。胚盤胞に導入されると、これらの細胞は桑実胚と凝集し、キメラ胚の形成につながる。キメラ胚は、奇形（胚）癌細胞の派生物が見られる様々な臓器や組織から構成される。しかし、このようなキメラ胚の圧倒的多数は子宮内で死亡し、生存した新生児キメラの臓器では異物細胞はほとんど検出されず、密度も低い。同時に、腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫、その他の悪性腫瘍、膵腺腫）の発生率が急激に増加し、キメラ胚の子宮内発育期間中に腫瘍の変性がしばしば起こる。

正常胚細胞の微小環境に存在するほとんどの奇形（胚）癌細胞は、ほぼ自然に悪性腫瘍の特性を獲得します。不可逆的な悪性腫瘍は、構造再編成の過程でプロトオンコゲンが活性化されることに起因すると考えられています。例外の一つは、マウス精巣奇形腫（系統129/Sv-ter）から得られた胚癌細胞株SST3の細胞であり、キメラマウスにおいて腫瘍形成を伴わずに胚の組織や臓器に統合する高い能力を示します。キメラマウスにおける奇形（胚）癌細胞株の誘導体は、一次生殖細胞の形成に実質的に関与しません。これは、ほとんどの奇形（胚）癌細胞株に特徴的な染色体異常の頻度が高いことに起因しており、これらの細胞では異数性と染色体異常の両方が観察されます。

多能性、高い増殖活性、培養増殖中の分化能を特徴とするヒト奇形（胎児）癌細胞の安定した株が、実験室環境でいくつか得られました。特に、ヒト奇形（胎児）癌細胞株NTERA-2は、神経細胞分化のメカニズムの研究に使用されました。この株の細胞を新生児ラットの前脳室下腔に移植したところ、細胞の移動と神経発生が観察されました。奇形（胎児）癌細胞株NTERA-2の細胞を培養して得られたニューロンを脳卒中患者に移植する試みも行われ、著者らによると、疾患の臨床経過が改善しました。同時に、脳卒中患者に移植された奇形（胎児）癌細胞株NTERA-2に悪性腫瘍が認められた症例はありませんでした。

マウスの未分化多能性胚性幹細胞の最初の株は、1980年代初頭にエヴァンスとマーティンによって、胚盤胞の内部細胞塊（胚芽）から単離されました。単離されたES細胞株は、特殊な培養培地中の因子の影響下で、多能性と様々な細胞種への分化能を長期間にわたり保持しました。

「胚性多能性幹細胞」という用語は、タバコタールが腫瘍発生率に及ぼす影響を研究していた際に、対照群の線状（129/v）マウスに精巣奇形癌が自然発生することに注目した、リロイ・スティーブンスによるものです。精巣奇形癌の細胞は増殖率が高く、腹腔液の存在下では自発的に分化し、ニューロン、ケラチノサイト、軟骨細胞、心筋細胞、毛髪および骨片が形成されましたが、対応する組織の秩序だった細胞構築の兆候は見られませんでした。培養すると、奇形癌細胞は基質に付着しない多能性クローンとして成長し、胚様体を形成しました。その後、分裂を停止し、ニューロン、グリア、筋細胞、心筋細胞へと自発的に無秩序に分化しました。スティーブンスは、マウス奇形癌129/vには、様々な特殊化した体細胞系に分化できる細胞が1%未満しか含まれておらず、分化自体はそれらに影響を与える要因（腹水組成、培養に添加された成熟細胞または組織の産物）に依存することを発見した。ルロイ・スティーブンソンの、奇形癌細胞の中に生殖系列の胚性前駆細胞が存在するという仮説は、成体マウスの組織における着床前胚由来の胚芽細胞の懸濁液から奇形癌が形成され、そこから分離された純粋な細胞株を受容動物の腹腔内投与後に、ニューロン、心筋細胞、および3胚葉由来のその他の体細胞に分化したことから、立証された。生体内実験では、ES細胞（胚芽細胞から採取したES細胞、栄養芽細胞からは採取していないES細胞）を、割球ステージ8～32のマウスの別系統胚に移植したところ、腫瘍を発症しないキメラ動物が誕生しました。その臓器にはドナー組織の芽生えが見られました。キメリズムは生殖細胞系においても観察されました。

マウス胚の生殖原基から単離された一次前駆生殖細胞は、形態、免疫学的表現型、および機能的特性において、スティーブンソンが奇形癌および胚芽細胞から得たES細胞と一致した。ES細胞を胚盤胞に導入した後に生まれたキメラでは、臓器のアロフェン形態形成は、肝臓、肺、腎臓において、ドナーとレシピエントの構造的・機能的単位がモザイク状に交互に出現する特徴を示した。場合によっては、レシピエント細胞とドナー細胞の両方からなる腸陰窩または肝小葉の形成が観察された。しかし、形態形成は常にレシピエントが属する種の遺伝プログラムに従って実現され、キメリズムは細胞レベルに限定されていた。

その後、選択栄養培地中にLIFが必須に存在すると、間葉系由来細胞（胎児線維芽細胞）のフィーダー層上で細胞分化を伴わずにES細胞が増殖することが確立されました。LIFは選択栄養培地中に必須に存在するため、幹細胞と前駆細胞のみが選択的に生存し、大多数の特殊な細胞要素は死滅します。このような方法を使用して、1998年にジェームズ・トムソンはヒト胚盤胞の内部細胞塊から5つの不死化ES細胞株を単離しました。同じ年、ジョン・ゲルハートは4～5週齢のヒト胚の生殖結節から不死ES細胞株を単離する方法を開発しました。その独自の特性により、わずか2年後には、ES細胞と確定組織の幹細胞が再生医療と遺伝子治療の現場で使用され始めました。