間葉系幹細胞

局所幹細胞のうち、間葉系幹細胞（MSC）は特別な場所を占め、その誘導体は人体のすべての臓器および組織の間質基質を構成する。MSCの研究における優先事項は、ロシア生物科学の代表者に属します。

最後の世紀の中頃に、多分化能性間質骨髄幹細胞の均質培養物がA.Friedenshteinの実験室で最初に単離された。長時間基板に取り付けられた間葉系幹細胞には食作用活性を有していない線維芽細胞クローンの形成された基板上に固定した後に低い播種密度で高い増殖速度、及び文化を保持していました。MSC増殖の停止は、骨、脂肪、軟骨、筋肉または結合組織細胞への自発的in vitro分化によって終了した。さらなる研究は、哺乳類の異なる種の線維芽細胞様骨髄間質細胞の骨形成能だけでなく、コロニー形成活性を明らかにしました。in vivoでの実験では、線維芽細胞コロニー形成細胞の両方のヘテロおよび同所性移植は、骨、軟骨、および線維脂肪組織を形成完了したことが示されました。同じ細胞株内対位法の自己再生および分化のための高い能力によって特徴付けられる骨髄の間質幹細胞ので、それらは多能間葉前駆細胞と呼ばれます。

間葉系幹細胞の45年間の基礎研究のために、実際の状態でそれらの誘導体を使用するための実際の条件が作成されていることに留意すべきである。

今日では、人体の全ての組織が、増殖、遊走、分化および成熟のプロセスの結果として異なる細胞系の幹細胞から形成されることは間違いない。しかしながら、より最近では、成体の幹細胞は組織特異的である、すなわち、それらが位置する組織の専用細胞株のみを産生することができると考えられていた。この概念的状況は、造血幹細胞の末梢血細胞成分への変換だけでなく、楕円形肝細胞への形質転換の事実によって否定された。加えて、神経幹細胞は、ニューロンおよび神経膠の要素ならびに造血前駆細胞の早期コミットラインの両方を生じさせることができた。次に、骨、軟骨および脂肪組織の細胞要素を産生する間葉系幹細胞は、神経幹細胞に形質転換することができる。成長、生理学的および修復的な組織再生の過程において、未確定の前駆細胞が組織特異的な幹貯蔵物から生成されると推定される。例えば、筋肉組織修復は、骨髄から骨格筋に移行する間葉系幹細胞を用いて実現することができる。

このような交差互換性幹細胞ではなく、すべての研究者を認識しますが、細胞移植と遺伝情報の細胞ベクターのためのソースとして間葉系幹細胞の臨床使用の可能性が分離することは比較的容易であることと伝播できる多能間質骨髄幹細胞、と反論していませんin vitroでの文化インチ 科学文献で同時に骨髄間質の多能性幹細胞の可能性について報告を引き続き表示されます。証拠としてMSCの分化転換の具体的な誘導物質の影響を受けて神経細胞、心筋細胞や肝細胞に変換され、研究プロトコルを提示。ただし、一部の科学者の深刻な疑問が初期胚発生時の再活性化および遺伝子発現への機会。同時に、誰もが条件は再生医療やプラスチックでESCの多能性への多能間葉系幹細胞を拡大することがわかっている場合は、自動的に、倫理的、道徳的、宗教的および法的性質の多くの問題を解決することを理解しています。この場合、患者の幹細胞再生能力の源は自己由来間質細胞であるので、解決し、細胞移植の免疫拒絶の問題です。近い将来の見通しはどのように現実的に表示されますされています。

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間葉系幹細胞の医薬品への使用

間葉系幹細胞の誘導体の臨床使用は、主に皮膚の広範かつ深い熱病変によって引き起こされる組織欠損の減少と関連しています。熱傷の治療のため、同種線維芽細胞様の間葉系幹細胞の適切性の前臨床実験的評価を行いました。線維芽細胞様骨髄間葉系幹細胞は、深い火傷の再生を最適化するためにそれらを移植することを可能にする文化の中で単層を形成することが示されています。著者らは、胚線維芽細胞は同様の性質を有するが、後者の臨床応用は既存の倫理的および法的問題によって制限されることに留意する。皮膚の全ての層に損傷を与えた深い熱傷をWistarラットでモデル化した。熱傷の面積は、皮膚の全表面の18-20％であった。第1の実験群は、深部熱傷および異種線維芽細胞様間葉系幹細胞の移植を伴うラットを含んでいた。第2の群は、同種異系胚線維芽細胞の深部熱傷およびトランスプランテーションを有する動物からなっていた。第3群は、深部熱傷を有する対照ラットに代表され、これは細胞療法を行わなかった。線維芽細胞由来の間葉系幹細胞および胚性線維芽細胞の懸濁液を、2×10の量にピペット火傷創傷表面に適用した⁴燃焼モデリングおよび壊死痂皮形成の切除後2日目に細胞。移植後、細胞をゲンタマイシンと等張塩化ナトリウム溶液に浸したガーゼで覆われた表面を焼きます。フェンス骨髄細胞は大腿骨から大人Wistarラットで生産間葉系幹細胞における線維芽細胞株のその後の誘導とMSCを取得します。胚線維芽細胞は、14〜17日齢の胚の肺から得た。プレMSCを取得するために、胚性線維芽細胞および骨髄細胞は、95％湿度、5％CO 2を含む雰囲気中で、C02のiikubatoreで37℃でペトリ皿で培養しました。単層形成のためMSC 14 17日から要求に対し、胚性線維芽細胞は、4~6日間培養します。その後MSCは解凍することによって調製し、4日間MSCを培養した線維芽細胞由来の間葉系幹細胞のための出発物質として凍結保存によって維持します。線維芽細胞発生の間葉系幹細胞の数は、同じ培養期間中に発生する胚線維芽細胞の3倍以上の数です。それらのゲノムを培養するステップでtranstslantirovannyh熱傷創傷における細胞を同定するためには、組換えアデノウイルスのV型キャリア1AS-2をコードする遺伝子β-ガラクトシダーゼ大腸菌に基づくウイルスシャトルベクターを用いて標識。様々な時点で生きている細胞は、移植後の特性青緑色を与え、添加した基質X-galで凍結切片で免疫組織化学的検出しました。視覚的なダイナミック、面積測定や火傷の組織学的評価条件の結果として、それも孤立グループ内の細胞の移植後3日目で、創傷治癒プロセスの間に有意差が現れていることがわかりました。特に、この差は細胞移植後7日目になった。線維芽細胞様の間葉系幹細胞を移植した第一の群の動物は、創傷がかなり小型化された肉芽組織が表皮のレベルにその全領域にわたって成長し、均一バラ強い色を取得し、表面を焼きます。傷の表面に形成されたコラーゲン皮膜はやや薄くなっていたが、火傷領域全体を覆っていた。胚性線維芽細胞を移植した第2グループの動物は、肉芽組織は、創傷縁の表皮のレベルまで上昇されるが、一部のみの場所で、創傷から同じ時間plazmoreyaでグループ1よりも強烈であり、最初に形成されたコラーゲンフィルムは、実質的に消失しました。7日目に細胞療法を受けていない動物では、火傷はフィブリンで覆われた淡い壊れた壊死組織であった。火傷表面全体には精液漏出が認められた。組織学的には、第一及び第二群の動物は、細胞浸潤と血管系の発達の減少を示し、初期の蓄冷プロセスのこれらの兆候は、グループ1のラットでより深刻となっています。対照群では、創傷の細胞浸潤の徴候があり、新たに形成された血管の組織学的パターンは存在しなかった。観察の15〜30日目には、第一グループの燃焼表面積の動物は他のグループのラットに比べて有意に小さかったと造粒表面はより開発されました。第2グループ燃焼表面積の動物にも限界上皮化に起因したラットの対照グループにおける火傷のサイズと比較して減少されます。対照群の燃焼表面サイトでクモ状静脈をその上に現れ、まれに淡い顆粒のまま、島は線維プラークは、火傷の表面全体に取り外し可能なかさぶたが残っ困難である何かを適度plazmoreyaを続けました。一般に、第3群の動物もまた創傷のサイズを縮小したが、創傷の縁はアンダーカットしたままであった。

従って、細胞療法の使用は、線維芽細胞由来の間葉系幹細胞と胚性線維芽細胞の移植の結果として、燃焼面の治癒の加速をマーク線維芽細胞由来の間葉系幹細胞や胎児線維芽細胞を使用して創傷治癒率の比較研究中、およびなし。しかし、治癒率線維芽細胞の創傷、同種間葉系幹細胞を用いた場合の胎児線維芽細胞の移植に比べて高かったです。これは、プロセスの再生段階の変化を加速する上で明らかにした - 細胞浸潤期間を減少させるために、血管ネットワークの増殖の速度、並びに肉芽組織の形成を増加させます。

動的プラノメトリーの結果は、（細胞療法を使用しない）熱傷創傷の自然治癒率が最も低いことを示している。治癒率線維芽細胞創傷の、同種間葉系幹細胞の移植後15日と30日に胚性線維芽細胞の移植に比べて高かったです。β-ガラクトシダーゼの検出のための組織化学的方法は、表面上の観察の全期間を通して、線維芽細胞様の間葉系幹細胞と胚性線維芽細胞の移植後、深い再生傷が移植された細胞が生存し続けることが示されました。著者は、火傷の再生率が高いが、生物活性因子rostostimuliruyushih成熟の間にこれらの細胞による線維芽細胞条件のリリースの間葉系幹細胞を用いたことを示唆しています。

火傷の治療のための自己または同種異系のケラチノサイトおよび線維芽細胞の同種の移植や診療所で使用されます。広範囲の熱傷を持つ子どもの外科的治療は、注入媒体を使用異なる反応に、外傷や外科的介入、重大な失血の高い多様に複雑な作業であることに留意すべきです。彼女の症状の重症度およびドナーの皮膚のリソースが不足しているため広範囲の熱傷、体表面の40％を超える面積、と皮膚や整形手術の実施における主要な困難。epiteliziruyutsyaセル穿孔後の画像は非常に遅く、多くの場合、皮膚移植片が溶解または乾燥されないので、大きな穿孔比のメッシュ移植片の使用は、問題を解決していません。そのようなコーティングはksenokozhaとして創傷火傷、死体同種移植片、合成フィルムコーティングは、必ずしも十分に効果的ではないので、培養ケラチノサイトおよび線維芽細胞の火傷表面層の閉鎖のための新たな方法の開発。具体的には、移植の際に提供培養allofibroblastovを使用して燃焼面を閉鎖する方法は、火傷に創傷境界に保存増殖epidermotsitovに対する刺激効果を顕著に、そしてケラチノサイトメッシュウェブをグラフト。Budkevich L.ら（2000）に子供の火傷の治療のためにこの方法を適用した結果を示します。1〜14歳の熱傷を有する31人の子供が観察されていた。3人の子供の総面積で傷のIIIA-Bを燃やす - 体表面の71から85パーセント - でも3で、50から70パーセント - IV度が40％、25でした。培養allofibroblastovとautodermaplastyの移植と組み合わせて早期の外科necrectomy。4：1のautodermoplasty穿孔比を有するマトリックスと皮膚フラップの除去 - 培養allofibroblastovキャリアフィルム（培養allofibroblastovの移植後48時間）第三の移植に - 第一段階処理において、第二の壊死組織切除を行いました。ひどい火傷病の病院に入院した3人の患者が、培養allofibroblastyは傷を粒状に移植しました。培養allofibroblastovの移植は二回、18人の子供に一度行わ - 11で、三から二人の患者を。細胞培養によって覆われた創傷表面の面積は30〜3500cm 2であった。皮膚フラップ、火傷の治癒と死亡数、重度熱傷の時間の生着の合計の割合で評価し、培養allofibroblastovの有効性。移植の移植は86％の患者で完了した。皮膚フラップの部分的な外観は、14％の症例で認められた。進行中の治療にもかかわらず、6人（19.3％）の子供が死亡した。それらの全皮膚病変領域は、体表面の40〜70％であった。培養allofibroblastovの移植は火傷一人の患者の死亡とは関係がありませんでした。

3年まで - - 年上の子供たちのために、30％の面積を持つ重要なの熱傷あり、治療の結果を分析し、著者は、幼い子供のための体表面の35から40パーセントの皮膚領域の深い熱的ダメージを（治療のための生活と互換性以前の火傷は、ことに注意してください年齢 - 身体表面の40％以上）。培養した場合necrectomyのallofibroblastovのautodermaplastyと大火傷と、その後の皮膚移植片の外科的移植、穿孔率がIIIB - IV度は重要なままですが、現時点でさえ、このような被災者の命を救うために、多くの場合、見通しがあります。熱傷の小児で培養allofibroblastovとautodermaplastyの移植と一緒に外科necrectomyは、ドナー部位の赤字と皮膚の高度な病変を有する患者において特に有効であることが判明しました。アクティブ外科戦術と移植培養allofibroblastovは、移植のために有利な条件を作成し、このような患者、火傷病の感染性合併症の数の減少の一般的な症状の急速な安定化を促進広範囲熱傷患者の死亡の発生率を減少させる、入院治療の失われた肌と持続時間を復元するための時間を短縮します。このように、培養allofibroblastovの移植は、以前に運命と考えられていた重度の火傷、と子どもたちの回復を実現autodermaplasty皮膚フラップを追いました。

火傷病の治療の主な目的は、損傷した皮膚の完全かつ迅速な回復を最大限にし、その結果生じる毒性効果、感染性合併症および身体の脱水を防ぐことであることは広く認識されている。培養細胞の適用結果は、熱傷創傷自体の移植の準備に大きく依存する。造粒創傷に生着率が15％に減少させながら外科necrectomy後の創傷表面に培養ケラチノサイトの移植の場合には、移植された細胞の（面積）は55％の平均をprizhivlyaetsya。したがって、広範な深部皮膚の火傷の治療に成功するためには、まず第一に活発な外科的戦術が必要である。火傷IIIB-IV度の存在下では、中毒の影響を減らし、火傷の合併症の数を減らすために、灼熱表面が壊死組織から直ちに放出される。このような戦術の使用は、火傷の瞬間から病院での大規模な火傷を患っている患者の傷や閉塞の閉鎖までの時間を短縮し、死亡者数を大幅に減らすための鍵です。

前世紀の80年代初期に、ケラチノサイトを培養して火傷表面を覆うことに成功した最初の報告が出されました。その後、この操作は、ケラチノサイトの培養細胞の層を用いて行われ、自己組織化から最も多く得られ、アロケチノサイトからの頻度はずっと少なかった。しかしながら、ケラチノサイトからの十分な移植片を産生するのに必要な時間は大きく、3〜4週間の量であるが、自己ケラチノサイト形成の技術は細胞バンクの作製を可能にしない。この期間中、病気や病気の合併症を発症する危険性が急激に高まり、病院内の患者の滞在期間が大幅に延長されます。さらに、火傷を造粒するための事実上autokeratinotsityのprizhivlyayutsya移植、および専門的な成長培地と生物学的に活性なケラチノサイト増殖刺激の高コストが大幅に彼らの臨床使用を制限します。そのような凍結保存ksenokozhi kollagenoplastika移植ならびに異なるバイオポリマーコーティングの使用などの他の生物工学的方法は広範囲ではなく、熱傷の表面処理の効率を高めます。培養した線維芽細胞を創傷表面にコーティングする方法は、培養細胞プールの主成分がケラチノサイトではなく線維芽細胞であるという点で根本的に異なる。

方法の開発のための前提条件は、小血管を囲む周皮細胞は、多くの成長因子を産生線維芽細胞、変身とによるケラチノサイトの増殖および付着に強い刺激効果に創傷治癒を提供できるプロgenitornymi間葉系細胞であることの証拠を務めていました。創傷の表面を閉じるための培養線維芽細胞を用いたが、直ちに培養ケラチノサイトの使用に対するこの方法の重要な利点の数を同定しました。具体的には、文化の中での線維芽細胞の調製は、移植の費用ケラチノサイトを得るための10倍以上のコストを削減した、特殊な培養培地および成長促進剤の使用を必要としません。彼らは部分的にそれらの表面組織適合性抗原を失い、その間線維芽細胞を簡単に順番に細胞の同種移植の製造のために使用し、その銀行を作成することを可能にした、継代に供されます。3週間（ケラチノサイト）（線維芽細胞用）1~2日から、診療所で使用するための準備ができて移植を受ける短縮。線維芽細胞の初代培養ヒト線維芽細胞の受信サブカルチャーにautodermoplasty及び細胞播種密度で採取した皮膚断片から細胞を培養することによって得ることができるだけ20×10 ³ 1センチメートルあたり²。

、ケラチノサイトの増殖および分化にコラーゲンタイプIおよびIIIおよびヒト線維芽細胞との共培養における、フィブロネクチンの基板上のケラチノサイト増殖の特性および形態の比較分析を、線維芽細胞およびそれらの調節タンパク質の効果を研究します。ヒトケラチノサイトは、自己播種術の手術中に摂取した熱傷患者の皮膚の断片から単離された。ケラチノサイトの密度は50×103細胞/ cm2であった。培養された線維芽細胞の移植の臨床的有効性は、517人の患者において評価された。すべての患者を2つのグループに分けた：第一 - 大人IIA、B - IVの火傷で影響を受けた; 第2児 - IIIB - IV度の深い熱傷を有する子供。グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、コラーゲンの再生プロセスにおける役割に関して、線維芽細胞の単層培養の構造的および機能的組織のダイナミクスの評価、および著者は移植の生産のための線維芽細胞培養物を使用する最も有利な条件として、三日目に決定することができました。ケラチノサイト、線維芽細胞の増殖および分化への影響の調査は、インビトロ線維芽細胞は接着細胞の数と2倍以上の固定速度を増加させる、主にケラチノサイト接着プロセスに、顕著な刺激効果を有する下ことを示しました。接着プロセスの刺激は、DNA合成の強度およびケラチノサイトの増殖レベルの増加を伴う。また、線維芽細胞およびそれらによって形成される細胞外マトリックスの存在は、ケラチノサイトの分化および基底膜形成のために、最終的に、装置ケラチノサイト間接続tonofibrillyarnogo形成のための前提条件であるとことが判明しました。熱傷の小児の治療では、特に赤字の皮膚ドナー部位の広範囲な病変を有する患者では、移植allofibroblastov文化の臨床的有効性を確立しました。複合morfofunktcionalnoeの研究は、移植特徴線維芽細胞外マトリックスのセル内に生成される活性なDNA合成、ならびにコラーゲン、フィブロネクチンおよびグリコサミノグリカン、。著者らは、10で（（96％まで）移植の線維芽細胞の生着の割合が高い、（ケラチノサイトの場合には2~3時間の代わりに24〜48週間以内）それらの製造の点で急激な減少、火傷表面の上皮化の実質的な加速、および価格の大幅な低下を示唆していますケラチノサイト移植と比較して線維芽細胞から移植片を成長させる技術の倍率（倍率）である。体表面の50％以上の熱傷、以前の生活と互換性がないと考えられていた - 培養allofibroblastovの移植の使用は重大な火傷で子どもたちの命を救うことが可能となります。胚性線維芽細胞の同種移植も説得力の様々な度熱傷や地域との傷や回復期の患者のより迅速な再生するだけでなく、死亡率の大幅な削減だけでなく、を証明したことは注目に値します。

自家線維芽細胞は、交換補正損傷声帯などの複雑で整形手術で使用されています。通常、この目的のウシコラーゲン、その免疫原性によって制限される作用の持続のために使用。外来タンパク質、ウシコラーゲン、コラゲナーゼ受信者に敏感であることとコラーゲン製剤の技術が開発されているリスクを軽減するために、免疫反応を引き起こすことができ、グルタルアルデヒドで架橋されました。その利点は、欠陥の除去及び声帯萎縮に実用化が見出されているより大きな安定性および低い免疫原性です。自己コラーゲンの注射は、1995年に初めて用いられた。方法は、酵素触媒分子内架橋を含む自家コラーゲン線維の一次構造の保全を提供します。天然コラーゲン繊維が前記カット再構成コラーゲンテロペプチドよりもプロテアーゼによる分解に対してより耐性であるという事実。整合性は、コラーゲン線維の四次構造と隣接するコラーゲン分子間の架橋のための重要なテロペプチド。ウシコラーゲンの準備とは異なり、自己のコラーゲンは、レシピエントにおける免疫応答を引き起こすことはありませんが、エージェントを満たすよう十分に有効ではありません。永続的な補正が原因線維芽細胞によるコラーゲンの自家移植の現地生産に達成することができます。しかし、診療所における自家線維芽細胞の移植の有効性の調査はいくつかの困難を明らかにしました。ウシコラーゲンの投与後に比べて早期に移植線維芽細胞の後に臨床効果が弱かったです。培養した場合、自家線維芽細胞は、線維芽細胞およびコラーゲン原線維の特異的相互作用に起因するコラーゲンゲルの減少によって証明されるように、線維症および瘢痕化の開発を担当異常、いわゆる筋線維芽細胞、における正常線維芽細胞の変換の可能性を排除することができません。さらに、連続継代した後、in vitroで線維芽細胞は、細胞外マトリックスタンパク質を合成する能力を失います。

上記の欠点を解消し、正常線維芽細胞の発癌性形質転換をもたらすヒト自家線維芽細胞のしかし、現在の実験技術が完成培養、。この方法によって得られた自己線維芽細胞は、顔の軟組織の欠損を満たすために使用される。H. Kellerらの研究（2000年）では、しわおよび萎縮性瘢痕を有する37歳〜61歳の20人の患者が治療を受けた。皮膚生検（4 mm）のBTE領域は、我々は、培養培地10mlを含有する滅菌チューブ（ダルベッコ抗生物質mikoseptikom、ピルビン酸およびウシ胎児血清）中で実験室に輸送しました。材料を直径60mmの3〜5個の培養皿の中に置き、5％CO 2を含む恒温槽中でインキュベートした。1週間後、細胞をトリプシン処理により皿から取り出し、25cm 2のバイアルに入れた。細胞を4×107重要かつ長期持続性の臨床的効果は、補正鼻唇溝を有する患者において観察された量で患者に投与し、そして自己由来線維芽細胞の第三の移植後7および12ヶ月後瘢痕を有する患者においてれます。フローサイトメトリーによれば、培養線維芽細胞は、大量のI型コラーゲンを産生した。インビトロ研究では、注射可能な繊維芽細胞の正常な収縮性が示されている。培養線維芽細胞を4×10 7細胞の用量で皮下投与した2ヵ月後、ヌードマウスは検出されなかった。注射可能な線維芽細胞は、患者において瘢痕形成およびびまん性線維症を引き起こさなかった。著者によると、移植された自己線維芽細胞は、コラーゲンを常に産生することができ、美容的な若返り効果をもたらす。この場合、分化細胞の寿命が限られているため、若年患者から採取した線維芽細胞は高齢者よりも効果的である。将来、若いドナーから採取された線維芽細胞培養の凍結保存の可能性は、後で彼自身の若い細胞の高齢患者に移植されると想定される。結論として、機能的保存の条件下での自己線維芽細胞は、顔の軟組織における欠陥の矯正の理想的な手段であるという完全に正しい結論ではない。同時に、著者自身は、研究の過程で、自己線維芽細胞 - コラーゲン系の使用に関連するいくつかの問題のある状況もまた生じたことに留意した。臨床効果は、ウシコラーゲンの使用よりもしばしば弱く、これは患者に失望をもたらした。

一般に、間葉系幹細胞の臨床使用の見通しに関する文献データは極めて楽観的である。変性関節病変の治療のために、自己骨髄多分化能間葉前駆細胞を使用する試みがなされている。骨の複雑な骨折の治療における培養された間葉系前駆細胞の最初の臨床試験が行われる。自己および関節軟骨外傷に起因する欠陥、または自己免疫病変の補正に移植するための軟骨組織を生成するために使用される同種間葉系間質骨髄細胞。多能間葉系前駆細胞の臨床応用の練習方法は、I型コラーゲン遺伝子の変異によって引き起こされる深刻な骨形成の進行に子供の骨欠損を修正します。mieloabelyatsii後未分画骨髄のようなHLA適合性の健康なドナーから移植された骨髄の子供たち、受信者は、重度の骨欠損を補充する間葉系幹細胞の十分な量を含有することができます。移植後、同種骨髄などの子供たちは、海綿骨の正組織学的変化、骨折の発生率の増加率の増減をマーク。場合によっては、密接に関連する同種異系骨髄および骨芽細胞を移植することによって、陽性の臨床結果が達成される。骨組織における骨芽細胞および破骨細胞の不均衡による骨の先天性脆弱性の治療のために、MSK移植もまた使用される。この場合の骨形成の回復は、患者の骨組織における幹細胞および前駆間質細胞のキメラ化によって達成される。

ドナー間葉系幹細胞の遺伝子改変の方法は、間質組織の遺伝的欠陥を修正するために改良されている。間葉系前駆細胞はすぐに方向性キメラの脳細胞のために神経内科で使用し、欠損酵素または疾患の臨床症状を担当する要因を発生させることができる健康な細胞のプールを、作成されることが想定されます。間葉系幹細胞の移植は、放射線療法および化学療法後、および骨髄細胞と組み合わせて、癌患者の骨髄間質を回復させて、造血を回復させるために使用することができる。MSCを用いた筋骨格系の欠陥を排除することを目的とした代替療法の開発は、間葉系幹細胞の子孫を生息骨格を形成する計画行列生体材料またはbiomimicsに工学を促進します。

間葉系幹細胞の供給源

間葉系幹細胞の主な供給源は、哺乳動物において絶えず間葉系幹細胞は、線維芽細胞のような骨髄間質細胞の小集団を提示し、一方、血液細胞と免疫系に分化した造血幹細胞の未分化状態を維持するのを助けるされた骨髄造血幹細胞です。特定の条件下では、間葉系幹細胞は、軟骨や骨の細胞に分化します。低密度植栽単核骨髄間質細胞培養培地上にプレーティングしたとき、実際には、線維芽細胞多能間葉前駆細胞である、付着細胞のコロニーを形成します。一部の著者は、骨髄が生活哺乳類生物全体のボディ前任者のすべての組織に間葉系間質細胞を提供し、自己再生と高分化能の能力のおかげで、コミットされていない間葉系幹細胞を、堆積していることを示唆しています。

骨髄において、間質細胞要素は、正弦曲線と骨組織の間の空間を満たすネットワークを形成する。成体の骨髄における休眠性MSCの含量は、造血幹細胞の数に匹敵し、0.01-0.001％を超えない。骨髄から単離され、培養に供されない間葉系幹細胞は接着分子を欠いている。そのようなMSCは、CD34、ICAM、VCAM、I型およびIII型コラーゲン、CD44およびCD29を発現しない。したがって、in vitroでの間葉系幹細胞を培養基質上に固定されていない、より高度な前駆由来間葉系幹細胞は、細胞骨格成分及び細胞接着分子の受容装置を形成しています。表現型CD34を有する間質細胞は、CD34陽性単核細胞より骨髄でははるかに少ないが、末梢血においても見出される。血液から単離し、線維芽細胞様細胞の基板と形コロニーに取り付けられたCD34 +細胞の培養に移しました。

胚期において、哺乳類およびヒトの全ての器官および組織の間質基底は、器官形成の段階の前および間に、間葉系幹細胞の共通プールから生じることが知られている。したがって、成熟した身体では、間葉系幹細胞の大部分が結合組織および骨組織に存在するはずであると考えられている。ゆるい結合組織および骨組織の間質の細胞要素の大部分は、コミットされた前駆細胞によって表されるが、in vitroで増殖およびクローン形成能力を保持することが確立されている。このような細胞が全血流に導入されると、間葉前駆細胞の20％以上が造血組織および実質器官の間質要素の間に移植される。

間葉系幹細胞の潜在的な供給源は、脂肪細胞前駆細胞の様々な程度で見出さコミット幹細胞の中でも脂肪組織です。間質血管細胞、骨髄の多能間葉前駆細胞はグルココルチコイド、インスリン様成長因子とインスリンの作用の下で脂肪細胞に分化することができるものと同じである - 脂肪組織の少なくとも成熟前駆素子。間質血管細胞の培養物中で脂肪細胞および骨芽細胞を形成している脂肪細胞および軟骨細胞および脂肪組織の骨髄由来の細胞に分化します。

筋肉には、間質性幹の供給源も見出された。ヒト骨格筋から単離した初代培養細胞は、星型の細胞と多核筋管を明らかにする。ウマ血清の星状細胞の存在下で細胞分化の兆候なしと分化培地が、骨格および平滑筋、骨、軟骨、および脂肪組織の表現型を有する細胞要素の細胞の出現によって特徴付けられるにデキサメタゾンを添加した後、in vitroで増殖します。その結果、コミットされた多能性間葉系前駆細胞および未確定多分化性間葉系前駆細胞の両方がヒト筋肉組織に存在する。骨格筋に存在する前駆細胞の集団がコミットされていない多能骨髄間葉系前駆細胞から来ている、と筋原衛星細胞と異なっていることが示されています。

それらは脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、骨格筋および心筋細胞の筋管に分化デキサメタゾンの影響下として新生ラットの心筋においても、多分化間葉系前駆細胞の分化能のために適切な、接着星状細胞を発見しました。血管平滑筋細胞（周皮細胞）は、多能性未分化血管周囲間葉系前駆細胞に由来していることが示されています。血管周囲の間葉系幹細胞の培養に平滑筋アクチンおよび血小板由来増殖因子受容体を発現し、少なくとも平滑筋細胞に分化することができます。

幹部埋蔵量の点で特別な場所は、多分化能性の間葉系前駆細胞または分化および成長因子の欠乏に起因する極めて低い修復能力があると考えられる軟骨組織である。軟骨および骨形成に予め供与された多能性間葉系前駆細胞は、他の組織源由来の軟骨組織に入ると考えられる。

組織起源および腱における間葉性前駆細胞の委譲条件も確立されていない。Ekspermentalnye観測は、第一通路における初代培養における出生後早期ウサギアキレス腱細胞およびI型コラーゲンとデコリンの発現を維持することを示唆しているが、さらに培養すると、彼らはtenotsitov分化マーカーを失います。

確かに多能間葉系前駆細胞の様々な組織に局在するかどうかの質問への答えは、常に彼らの間質に存在している、または間葉系幹細胞の組織プールは、それはまだ待っている間質性骨髄幹細胞の移動により補償されることに留意すべきです。

成体生物の骨髄および他の間葉組織ゾーンに加えて、MSCの別の供給源は臍帯血であり得る。臍帯静脈血が潜在能力を異ならせることにより、骨髄由来の多能間葉系前駆細胞の接着が可能ではなく、劣っている多能間葉系前駆細胞と類似した形態学的および抗原性の特性を有する細胞が含まれていることが示されています。5〜10％コミットされていない多能性間葉系前駆細胞から検出された臍帯血の間葉系幹細胞の培養物中。これは、臍帯血中にその数は胎児の発育中の様々な組織への多能間葉系前駆細胞の移動の間接的な証拠である在胎週数に反比例していることが判明しました。胎児の幹細胞の既知の能力に基づいている臍帯血から単離した間葉系幹細胞の臨床応用のほか、胚派生生体材料に関する最初の情報を統合し、臓器や組織のシステムの成人レシピエントにおける機能prizhivlyatsyaありました。

間葉系幹細胞の新しい供給源の探索

胎児起源の間葉系幹細胞の使用は、他の胎児細胞と同様に、多くの倫理的、法的、法的および立法上の問題を引き起こす。従って、胚体外細胞臓器材料の探索が続けられる。試みは、ヒト皮膚線維芽細胞の失敗した臨床アプリケーションは、それははるかに少ない可能性増殖を有し、成長因子の限られた数を生成する線維芽細胞に技術の高い財務能力だけでなく、線維細胞の迅速な分化だけでなくすることによって決定したでした。生物学およびMSCの分野におけるさらなる進歩は自家間葉系幹細胞の臨床使用のための戦略を開発することができ多能間葉骨髄前駆細胞です。まず、MSCの分子マーカースペクトルの研究が必要であり、それらの単離、栽培、生体外生殖および指向性分化の技術が必要であった。それらの分析は、ヒト骨組織の初代培養において、多能性間葉系前駆細胞のいくつかのタイプが存在することを示した。前骨芽細胞表現型は、間質前駆細胞STRO-1のマーカーを発現しているが、骨芽細胞マーカーであるアルカリ性ホスファターゼを保有していない細胞で見られた。そのような細胞は、石灰化骨基質を形成する能力が低く、オステオポンチンおよび副甲状腺ホルモン受容体の発現がないことを特徴とする。アルカリホスファターゼを発現しないSTRO-1陽性細胞の誘導体は、中間および完全に分化した骨芽細胞によって表される。ヒト小柱骨のSTRO-1陽性細胞のクローン化された系統の細胞要素は、成熟骨細胞および脂肪細胞に分化することができることが確立されている。IL-1Bおよび腫瘍壊死因子（TNF-α）、ならびに抗炎症および免疫抑制TGF-B - これらの細胞の方向への分化は、多価不飽和脂肪酸、炎症性サイトカインの露光に依存します。

CD45、CD34及びCD14 - 後でそれは多分、間葉系前駆細胞にのみ固有の表現型、それらに特有の欠けが、間葉系、内皮細胞、造血細胞免疫表現抗原の発現の非存在下における上皮細胞および筋細胞に特徴的な、複雑なマーカーを発現することが分かりました。また、間葉系幹細胞および構成的誘導的造血および非造血成長因子、インターロイキン、及びケモカインを産生し、そして多能間葉系前駆細胞において、いくつかの増殖因子およびサイトカインに対する受容体を発現しました。「大人は」幹細胞マーキング、これらおよび他の細胞はCD117を表現 - 間質細胞の中に人間の体の基本は生の5-フルオロウラシル多能間葉系前駆細胞の抗原性プロファイルとほぼ同じ免疫とdormantnyeまたは休止細胞を、見つけました。

したがって、間葉系幹細胞に特有の細胞マーカーは未だ確立されていない。それらは、変形性関節症（CBFA-1）または脂質生成（PPAR-Y-2）にコミットの細胞マーカーを発現しないので、休止細胞が多能間葉前駆細胞のコミットされていない集団であることが想定されます。急速な成長によって特徴づけられる最終分化コミット前駆体の形成にウシ胎児血清結果、ゆっくりと増殖する細胞を休んでの長期暴露。このような幹間葉系細胞のクローン成長は、FGF2によって支持される。これは、ゲノム由来間質幹細胞はタイトな十分のMSCにおける自発的分化の欠如について報告されている「閉じた」ように見える - 。でも、彼らは間葉系の細胞に変換されていないをコミットするための特別な条件なし。

人口を研究するために構造由来の間葉系幹細胞は、間質細胞株および初代培養に分化マーカータンパク質を探索しています。クローンコロニーアッセイ骨髄細胞においてインビトロでEGFの初代培養を受けたときヒドロコルチゾンの添加は、MSCの向きの骨形成分化のマーカーであるアルカリホスファターゼの発現を活性化しながら、コロニーの平均サイズを増加させ、アルカリホスファターゼのクローン発現を減少させることを見出しました。STRO-1に対するモノクローナル抗体は、異種システムデクスター培養におけるSTRO-1陽性接着細胞の集団を分離して研究することが可能となります。サイトカインのスペクトルだけでなく、増殖および造血およびリンパ系細胞の分化を調節するだけでなく、形成、パラ、自動及び内分泌機構によって形成および骨格組織の再吸収に関与します。また、cAMP、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、およびCa 2+のような二次メッセンジャーの受容体媒介性放出は、関連受容体を発現する細胞の間質組織の異なるカテゴリのマーカーの分析のために使用されます。T及びB依存性ゾーンの細網細胞に属する間質リンパ器官を確立させマーカーとしてのモノクローナル抗体の使用。

いくつかの時間、造血幹細胞からのMSCの起源の可能性について、科学的な論争が続いた。実際に、単層培養への骨髄細胞の懸濁のexplantationで、線維芽細胞の個別のコロニーがそれらの中で成長する。しかし、骨髄の一部として線維芽細胞コロニーおよび造血組織の雑菌分化の前駆体の存在は、造血幹細胞の彼らの共通の起源の証拠ではないことが示されています。造血細胞のhistogenetic MSCの人口の独立した骨髄に、存在を証明異移植での微小環境は、骨髄の造血細胞が転送されることがわかった骨髄幹細胞の判別分析を、使用します。

それらの特性を研究するために、それらの数を決定するために、前駆細胞の新たなカテゴリの骨髄間質細胞の単層培養で明らかに加えて、選択的なクローニング法、増殖および分化ポテンシャル。これは、in vitroで線維芽細胞様ストローマ細胞が増殖し、二倍体コロニーを形成することが見出されたときに新たな血液形成器官の形成を確実に身体に逆移植。個々のクローンの研究の結果は、間質組織の幹細胞、間質前駆細胞中の造血幹細胞のGistogeneticheskajaは独立の役割を主張することができ、その増殖と分化電位の細胞の集団が存在していることを示しています。この集団の細胞は、自立増殖を特徴とし、骨、軟骨および網状骨髄組織の前駆細胞に分化する。

非常に興味深い研究培養骨髄由来の間質前駆細胞ウサギ、モルモット、およびウシ胎児血清を補充し-MEM培地のマウスであったChailakhyan R.ら（1997年から2001年）の結果があります。著者らは、1cm 2当たり2〜4×103の骨髄細胞の初期密度で外植片を実施した。使用されるフィーダー同種または異種用量フィーダ保持動作における骨髄細胞の照射により不活性化が、完全に遮断され、増殖します。線維芽細胞の2週間の一次分離コロニーをトリプシン処理してモノクローナル菌株を産生した。証拠クローン起源のコロニーはオスとメスのモルモット、タイムラプス撮影ライブの文化、の骨髄の混合培養ならびに同系マウスとCBA SVAT6T6の骨髄の混合培養における染色体マーカーを用いて得られました。腎被膜下、インビトロまたは間質線維芽細胞中で増殖させた新たに単離した骨髄細胞の移植スラリーをivalonovyh多孔質足場またはゼラチン、ならびに不活性化ウサギ海綿骨基質で行いました。軟部組織および骨膜からきれいに骨カバー太もものモルモットに移植クローンは、骨端をカットし、徹底的に自分の骨髄を洗浄します。骨を断片（3〜5mm）に切断し、乾燥し、60Gyの線量で照射した。骨のカバーでは、個々の線維芽細胞コロニーを筋肉内に配置し、移植した。in vitroで増殖させた間質線維芽細胞の腹腔内移植のために、我々は、タイプに拡散チャンバ（V = 0015センチメートル3、H = 0、LのMM）およびD（V = 0,15 cm 3で、H = 2 mm）を用います。

クローン株Chailakhyan R.ら（2001）の増殖の動態を研究する際に、個々の細胞は、コロニー形成、線維芽細胞、ならびにその子孫が大きな増殖能を有することを見出しました。第10回継代までに、いくつかの株の線維芽細胞の数は、1.2〜7.2×10 ⁹細胞であった。開発の過程で、彼らは31-34までの細胞の複製を行った。したがって、間質前駆体で数十個のクローンを形成骨髄由来株の異移植は、新しいゾーンの造血臓器移植における骨髄微小環境と教育の移転につながりました。著者は、個々のクローンは、骨髄微小環境の間質細胞を許容できるかどうかの問題を提起し、またはそれは、いくつかの異なるクローン原性間質前駆細胞の協力が必要？そして、個々のクローンは、それがすべての3人の生殖血のいっぱいある、または異なるクローンが異なる病原菌のための造血微小環境の形成を提供するかどうかを、微小環境を転送することができるようになりますか？これらの問題に対処するには、あなたがそれに続く異移植のためのコロニーを成長した線維芽細胞の表面から撮影することができますコラーゲンゲルで栽培間質前駆細胞の技術を開発してきました。個々のクローン間質線維芽細胞、CBAマウス及びモルモットから成長した骨髄細胞は、ゲルコートと移植異の断片とともに切断-同系マウスまたは自家筋腹モルモットの腎臓被膜下。筋肉への移植の際に、ゲル上のコロニーを骨の覆いに置いた。

我々は、骨または骨および造血組織の移植領域の現像で観察された例は20％で、骨髄線維芽細胞コロニーの移植後50〜90日まで。レシピエント動物の5％において、形成された骨組織の病巣には、骨髄で満たされた空洞が含まれていた。骨シリンダの内部にそのような病巣は、丸みを帯びた形状と骨組織の構築カプセル、骨細胞とよく開発骨芽細胞層を有しています。骨髄腔は、骨髄および赤血球細胞と正常な骨髄のそれと異ならないその割合を網状ファブリックが含まれています。腎臓移植は、骨カプセルが腎カプセルからのみ髄腔を覆うネイティブ骨髄移植、によって形成された典型的な髄様体でした。フード付きの組織には、骨髄系、赤血球系および巨核球系の要素が含まれていた。髄腔の間質はよく発達した正弦波系を有し、典型的な脂肪細胞を含んでいた。造血の兆候はいくつかのコロニーの骨の移植の領域で同時に、腎臓被膜下が認められました。個々のクローンの増殖および分化効力の研究は、細胞が培養培地中およびウサギ骨髄ドナーの腎臓被膜下に隠れ1~2 mgの計量別ivalonovoyスポンジ中に再懸濁され、モノクローナルウサギ骨髄株を継続しました。このような自己移植は、21のモノクローナル株の細胞に供された。結果は2-3ヶ月で考慮された。著者らは、移植された骨髄モノクローナル株の14％は、造血細胞で満たされた骨および骨髄腔からなる本体を形成することを見出しました。症例の33％に骨芽細胞及び先進層にレンガostootsitami異なるサイズの空洞を有する緻密骨に形成された株を移植しました。いくつかのケースでは、スポンジ移植クローンは骨または造血細胞なし胞体を開発しました。時々網様間質の形成は、正弦波のよく発達したネットワークで発生しましたが、造血細胞を移入されません。したがって、得られた結果は、コラーゲンゲル上のクローンの移植によって得られたものと同様でした。15％網状織物 - - しかし、クローンの移植は、骨髄組織が形成された基板上に成長させた場合には、骨の5％は、症例の80％において、移植モノクローナル骨の症例の14％で観察された骨髄細胞の形成を株 - 53％、網状 - 症例の53％であった。著者によると、これは、多孔質足場に移植間質性線維芽細胞の増殖および分化ポテンシャルを実現するための条件は、骨の中の彼らの移植よりもより最適であったことを示しているとコラーゲン基質をカバーしています。クローンのフィードバックの栽培と移植のより高度な方法の使用は、そのクローンの分化能を実現するための条件を改善し、これらの関係を変えることができることを排除するものではありません。一つの方法または別の、しかし、研究の主な値は、骨髄血の3つのもやしのためにすぐに間質性造血微小環境を確保しながら、骨組織を形成することができるというクローンのいくつかは、間質細胞事実にある：十分な大き拠点造血組織を作成し、赤血球、骨髄および巨核球といくつかの骨量。

さらに、著者らは、拡散チャンバーの閉じた系の状態において、個々のクローン間質前駆細胞のこれらのタイプの細胞分化の能力の問題を解決した。さらに、それは可能性を区別するための多能展示または表示の個々のクローンかどうかを決定することが必要であった骨、軟骨又は網状の優先的な形成を決定する異なる比が固定符号細胞分化、を有するいくつかのクローンの協同的相互作用を必要とします。2つの方法論的アプローチを組み合わせることによって、 - モノクローナルが骨髄間質前駆細胞を単離および拡散チャンバーにそれらを移植し、Chailakhyan R.ら（2001）は、骨髄間質の構造組織の理解を接近させた結果を得ました。O型細胞への移植モノクローナル株間質前駆細胞は、同時に、骨および軟骨を形成する1つのコロニー形成間質細胞の子孫の能力を実証する、両方の骨および軟骨組織の形成をもたらしました。骨および軟骨組織が共通の間質前駆細胞に由来するという仮定は、繰り返し繰り返し示されている。しかしながら、この仮説は正しい実験的確認を有さなかった。拡散チャンバーで骨および軟骨形成は、組織のこれら2つのタイプに共通の骨髄間質前駆細胞を含む幹細胞の存在を証明する必要がありました。

次いで、ウサギの骨髄の初代培養物から得られた第2および第3継代の29個のクローン株を拡散チャンバーに入れ、同種の動物を腹腔内に移植した。研究により、骨髄モノクローナル株の45％が骨形成能を有することが示されている。例外的に、網状組織には9個のチャンバーが含まれていたが、骨および軟骨組織とともに13個のチャンバーに存在し、全系統の76％を占めていた。骨および軟骨組織の両方で分化が可能なO型のチャンバーでは、16株が研究された。4つの室（25％）では、骨および軟骨組織の両方が形成された。再び研究はChailakhyan R.ら（2001）は、個々の前駆細胞が31〜34倍加から成る細胞株を受け、そしてその子孫は0.9~2.0×10であったことに留意すべきである⁹細胞。ポリクローナル菌株の前駆細胞が曝露された有糸分裂の数は、実質的にモノクローナル菌株の細胞のものと同じであった。同時に、ポリクローナル株の発生率は、特にそれらの形成の第一段階において、株の開始に使用されたコロニーの数にかなりの程度依存していた。12-15レベルの重複で再形成された場合、ヒト胚線維芽細胞（WI-38）の二倍体株も直径および細胞内の細胞含量が異なるコロニーを形成した。103個を超える細胞を含む大きなコロニーは、わずか5〜10％であった。分裂数の増加に伴い、大きなコロニーの割合が減少した。モノおよびポリクローナル骨髄間質線維芽細胞株は、20回の以上の倍加後に設定さ二倍体の染色体を保持し、そして開発の傾向は、二倍体株胚性線維芽細胞の動態に匹敵しました。モノクローナル菌株を拡散チャンバーに移植することによって実施された個々の骨髄間質前駆細胞の分化能の分析は、それらの半分が骨形成性であることを示した。大規模なコロニーは総数の10％を占めていた。その結果、骨形成コロニー形成細胞の数は、それらの全集団の約5％に相当した。著者らは、骨と軟骨の両方を形成することができる骨形成前駆細胞に存在する細胞の総重量を同定しました。成体のこれらの2つのタイプの組織について、共通の前駆細胞が存在することが最初に確立された：試験されたクローンの25％が類似の細胞によって作製され、その前駆細胞の一般集団中の数は少なくとも2.5％であった。

したがって、骨髄線維芽細胞の個々のクローンの異種移植は、間葉系前駆細胞集団の構造的構成の新しい局面を開いた。異なるモデルの大きな検討クローンのうちの数が5〜15％（検出された前駆細胞の総数の0.5から1.5パーセント）であり、すべての造血幹のためにすぐに特定の微小環境を転送することができるが見つかりました間質前駆細胞。クローンとともに、完全な骨髄微小環境を転送する、唯一のオープンシステムに転送フォーム骨形成、造血の開発をサポートしていない骨に決定論的な前駆細胞は、あります。前駆細胞の総数からのそれらの数は1.5〜3％である。これらの細胞のいくつかは、自己維持の限られた期間で骨組織を形成することができる。その結果、間質前駆細胞の集団は、その分化能が異種である。その中で、骨髄間質組織に固有のすべての3つの次元に分化骨、軟骨および網状組織を形成することができる間質幹細胞の役割を主張し、セルのカテゴリがあります。これらのデータは、私たちは、様々な細胞マーカーの助けを借りて、特定の組織の微小環境における間質細胞の各タイプの寄与を決定し、デクスター培養において造血をサポートすることが可能であろうことを期待することができます。

間葉系幹細胞の特徴

近年では、骨髄の静止培養物では間葉系多能性前駆細胞は、細胞を増殖のための特定のKi-67抗原の発現のコロニー形成および不在の低機能によって特徴づけられる小さな無顆粒細胞（RS-1）細胞の限られた人口を発表したことがわかりました。休眠RS-1細胞の抗原性パラメーターは、急速に増殖するコミットされた間質前駆細胞の抗原スペクトルとは異なる。コミットされた前駆細胞の高い増殖速度がRS-1細胞の存在下でのみ観察されたことが見出された。次に、RS-1細胞は、最も成熟由来多間葉前駆細胞によって分泌される因子の影響下で成長速度を増大させます。RS-1細胞はリサイクル可能なコミットされていないMSCのサブクラスであるようです。マーカー非増殖細胞 - 低RNA含量およびオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子の高レベルの発現によって特徴付けられる骨髄の5-フルオロウラシル間質前駆細胞に耐性をインビトロで。

間質前駆細胞の集中的な複製は、基材上での固定後に始まる。SH2（TGF-β受容体（3）、SH3（ドメインシグナル伝達タンパク質）、コラーゲンタイプIおよびIII、フィブロネクチン、接着レセプターVCAM-1（CD106）およびICAM（CD54）、カドヘリン11：これは、低分化細胞のマーカープロフィールを発現させる場合、CD44、CD71（トランスフェリン受容体）、CD90、CD120a及びCD124が、造血幹細胞（CD34、CD14、CD45）に特徴的なマーカーを発現せず。クローン成長は、多くの遺伝的に均質な間質前駆細胞の多能性の培養物を生成するために、繰り返し継代間葉系幹細胞を有効に細胞。2-3その数の通路は、50から300000000に達した。十分な密度の培養において間質前駆細胞の増殖を停止した後、造血組織線維芽細胞は脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、及び骨組織に分化とは異なり3つの分化の調節シグナルの組み合わせを1-メチルizobutilksantin（細胞内cAMP形成のインデューサー）、デキサメタゾン及びインドメタシン（シクロオキシゲナーゼ阻害剤、トロンボキサン活性低下と）（ホスホリパーゼA及びCの阻害剤）を含むでオン 脂肪前駆細胞の95％までが前駆細胞である。未熟な間質細胞から脂肪細胞形成は、リポタンパク質リパーゼ遺伝子、アポリポタンパク質およびペルオキシソーム受容体の組織化学的同定の発現を確認しました。無血清培地中でTGF-bの影響を受け、同じクローンの細胞は、軟骨細胞の均質な集団を作成します。軟骨細胞外マトリックスの多層細胞培養物を特徴としているプロテオグリカン及びコラーゲンII型からなる開発。同じ培養間質前駆細胞前駆細胞におけるB-グリセロリン酸からなる10％胎児血清効果分化シグナル複合体（供与無機リン酸）、アスコルビン酸およびデキサメタゾンを含む栄養培地は、細胞集合体の形成をもたらします。このような細胞では、細胞は、細胞内カルシウムの漸進的な増加を確認した骨石灰化の形成を示す、アルカリホスファターゼ及びオステオポンチンレベルの活性の漸進的増加があります。

いくつかによれば、間葉系幹細胞の能力は無限に分裂し、可塑性の高い組み合わせ間葉系細胞の様々なタイプの再生。心室、又は白質に投与された場合、間葉系幹細胞は、神経組織の実質に移行し、ニューロンまたはグリア由来細胞株に分化します。加えて、インビトロで、およびインビボの両方での造血幹細胞におけるMSCの分化転換に関する情報があります。アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、心筋、平滑筋細胞および骨格筋細胞に分化する能力が明らかにされたMSCの例外的に高い延性を決定いくつかの研究で、より詳細な分析。多くの研究は、in vitroおよびin vivoでのMSCの電位をtransdifferentsirovochnogoに骨髄由来の多能性間葉系前駆細胞は、末端細胞、骨、軟骨、筋肉、神経および脂肪組織を形成する線、ならびに腱および造血を支持する間質に分化することがわかっ。

しかし、他の研究では、何の間葉系幹細胞の制限多能性ゲノムの兆候とは、間質前駆細胞集団を検出されないことができませんでしたが、初代培養から分離された200個の以上のMSCクローンを調査した可能性多能性間質細胞を確認すること。in vitroでのクローンの大半は、骨形成、軟骨形成および脂肪生成方向に分化する能力を保持しました。腎臓被膜下または拡散チャンバーで間葉系幹細胞の移植によって、レシピエント細胞の移動の確率を除くとき、その場で、間質前駆細胞は、ゾーン移植制限因子または単独で多能性MSCの不在の不在のいずれかを示す異種表現型を保持することが登場しました。同時に、成体幹細胞の共通前駆体である体性多能性幹細胞のまれなタイプの存在を可能にしました。

マルチではなく、真の多能性間葉系幹細胞は骨髄細胞のごく一部を構成し、in vitroで骨の中の細胞の彼らの誘発系譜コミットメントによって証明されるように、分化に入ってくるせずに増殖する培養したとき、特定の状況では、可能であり、軟骨、脂肪、筋肉組織、ならびに造血を支持する腱細胞および間質要素に存在する。典型的には、ウシ胎児血清を含む培地中の連続曝露は、自発的最終分化を受ける子孫その委任前駆細胞の間質における出力MSCを、引き起こします。分化シグナルデキサメタゾンおよびインスリンの組み合わせは、脂肪細胞の形成を誘導しながら、媒体コンディショニングデキサメタゾン、β-グリセロリン酸およびアスコルビン酸を添加することにより、指向骨芽細胞形成を達成することができるin vitroで。

特定の培養条件を作成するために、骨髄MSCの分化の段階に入る前に、最初に線維芽細胞様の間葉系幹細胞に分化することを確立しました。in vivoでのこれらの細胞の誘導体は、骨、軟骨、腱、脂肪や筋肉組織などの間質サポート造血の形成に関与しています。多くの著者は、実際のMSCとしての用語「多能間葉系前駆細胞」、およびコミット間質前駆細胞と骨髄間葉系組織を理解しています。骨髄由来の間葉多能性前駆細胞のクローン分析は、他のクローン細胞に対し、骨関節炎、hondro-及び脂肪細胞に分化したクローンのわずかに1つ以下の第三は、骨形成能と形態のみhondro-と骨を持っていることを示しました。骨芽細胞、軟骨細胞および造血を支持進potsitovが、間質細胞だけでなく表現型および機能的特徴を有する細胞に分化し、適切な条件の微小環境下IUD-9のような多能間葉前駆細胞のこのクローン、。異なる表現型のRCJ3.1差別化間葉系細胞は、胎児ラットの骨髄細胞からクローン分離されました。このクローンの細胞要素からアスコルビン酸、B-グリセロリン酸、およびデキサメタゾンの組み合わせ作用によって第多核筋細胞を形成した後、順次、脂肪細胞、軟骨細胞および膵島鉱化骨です。、骨関節炎および脂肪細胞および平滑筋細胞の分化のマーカーを発現しない、増殖率が低いことを特徴とし、hondro-形成する培養条件下で分化したようにラット胎児の骨膜から顆粒細胞の集団は、コミットされていない多能性間葉系前駆細胞に相当します。

このように、間葉系幹細胞のplyuri-または多能ゲノムの質問は、結果としても、完全にインストールされていない間質前駆細胞の分化能のプレゼンテーションに影響を与える、まだ開いていることを認識すべきです。

実験的に証明された間葉系幹細胞の重要な特徴は、組織のニッチを残し、全身循環内を循環する能力です。分化の遺伝的プログラムを活性化するためには、そのような循環幹細胞は適切な微小環境に入るべきである。異なる器官および組織に移植された細胞を未成熟血流のMSCのレシピエント動物に全身投与された場合、その後、血液細胞、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、および線維芽細胞に分化することが示されています。その結果、局所的な組織領域における信号の規制にコミットし、コミットされていない間質前駆細胞の相互作用だけでなく、それらと周囲の成熟細胞の間に発生します。分化誘導が多能性間葉系前駆細胞の微小環境における空間的および時間的な関係を提供間葉起源とnemezenhimalnogo（成長因子、エイコサノイド、細胞外マトリックス分子）のパラクリン調節因子を行っているものとします。したがって、間葉組織の局所的な損傷は、多能間葉前駆細胞の生理学的プロセスを修復再生するのではなく、発生した複雑な調節シグナル無傷の組織から定性的に異なる微小環境ゾーンの形成をもたらすべきです。この相違は、正常で損傷が誘発された微小環境における細胞表現型の特殊化に関して極めて重要である。

この考えによれば、2つの既知のプロセス（生理学的再生と炎症増殖）の根本的な違いのメカニズムが築かれています。その第1のものは、特殊化した細胞組織組成およびその機能の回復で終わるが、増殖プロセスの結果は、成熟した結合組織要素の形成および損傷組織ゾーンの機能の喪失である。従って、再生プラスチック医学における多分化能間葉系前駆細胞の使用のための最適プログラムの開発のためには、微小環境因子がMSCの分化に及ぼす影響の特性を注意深く研究する必要がある。

発現が外部シグナルによって調節される細胞性パラおよびオートクリンレギュレーターに対する幹細胞コンパートメントの構造の依存性は誰も疑いはない。調節因子の機能の中で最も重要なのは、MSCの非対称分裂の制御、および分裂の段階および細胞分裂の数を決定する遺伝子の発現である。MSCのさらなる発展が依存する外部信号は、それらの微小環境によって提供される。脂肪細胞ライン、筋線維芽細胞、造血間質組織、軟骨細胞、及び骨に分化する能力を維持しながら、未熟のMSCにおいて、十分に長い時間を増殖します。それは一般的な循環からSB34陰性間質細胞要素循環の制限された集団が、骨髄間質組織に返されることが見出され、ラインCD34陽性造血幹細胞に形質転換します。これらの観察は、組織の血流中の循環前駆間葉系細胞は、未熟骨髄間質細胞の共通プールを動員することによって、異なる器官における間質幹細胞のバランスのためのサポートを提供することを示唆しています。複数の間葉表現型と実験動物における養子免疫伝達モデルにより実証in vivoで骨、軟骨、腱および脂肪組織の修復または再生への参加を持つ細胞へのMSCの分化。他の著者らによれば、MSCの血管床の遠隔移動は局所的な変位または修復軟骨、筋肉再生、および他の還元反応において組織内korotkodistantnym多能性間葉系前駆細胞と組み合わせられます。

ローカル埋蔵量は、間質組織の基盤は、生理的組織再生過程における細胞の役割ソースを再生し、間質組織幹リソースを費やして遠くの輸送のMSCによって補充される幹。しかしながら、このような複数の外傷などの細胞修復能力、の緊急動員を必要とする、再生の修復プロセスでのMSC全体の列車を参加し、血流を介して周囲は、骨髄の間葉系前駆細胞を動員。

間葉系幹細胞の移植

組織の生理学的再生のプロセスと、子宮内発達の期間におけるそれらの形成との間には、一定の類似点がある。ヒトおよび哺乳動物の胚、エクト、メソ及び内胚葉胚葉のプールに由来する特殊化した細胞の種々のタイプの形成が、間充織の必須参加有します。胚間葉組織の緩やかな細胞ネットワークは、多数の調節、代謝、骨格および形態形成機能を行う。ブックマークprovisory体は、プライマリ形態形成信号器官を生成する成長クローン原性前駆細胞を犠牲にして凝縮間充織後に行われます。胚性間葉系の間質派生物は、暫定器官の細胞骨格を作り出し、原発性血液およびリンパ管を成長させることによって将来のエネルギー供給の基礎を形成する。換言すれば、胎児器官の微小循環単位の間質要素は、それらの構造機能単位の形成前に現れる。さらに、器官形成中の間葉系細胞の能動的な移動は、ホメオティックなNoch-Tepsの制限によるそれらの体積境界のマーキングのため、発生器官の空間的な配向を提供する。間質骨格にしばしば、形態形成的および機能的に非常に異なる細胞を含む、実質器官の構造と機能ユニットのために発生し、アセンブリ。その結果、胚形成において、間葉機能が主要であり、前駆上皮細胞の局所的な増殖および分化を活性化する調節シグナルを生成することによって実現される。胚間充織細胞は、実質細胞前駆体細胞が対応する受容体を有するLEG、HGF-b、CSFなどの成長因子を産生する。成体生物間質細胞ネットワークの成熟分化した組織はまた、原点をnemezenhimalnogo前駆細胞の生存率および増殖を維持するための信号を生成します。しかし、出生後におけるスペクトル間質調節シグナル個体発生他（SCF、HGF、IL-6、IL-1、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、GM-CSF、FLT-3、 LIFなど）、損傷した組織領域の生理学的再生または修復を目的としている。さらに、各種類の組織および同じ器官内でさえ、間質調節因子のスペクトル特性は異なる。特に、造血および免疫担当細胞の増殖および分化の造血およびリンパ球は、造血およびリンパ系細胞の成熟のための条件を提供する間質微小環境を作用する内のみ特定の臓器に発生します。これは、微小環境が増殖し、その微細構造のニッチに成熟するために身体を再増殖する造血およびリンパ系細胞の能力に依存して制御因子次第です。

多能性間葉系前駆細胞を産生する細胞外マトリックスの成分の中でも、細胞間相互作用の組織における主要部と骨髄および骨における細胞外マトリックスの形成を受け、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカン、ならびにCD44（ヒアルロン酸およびオステオポンチン受容体）に留意すべきです。骨髄間葉系は、多能性細胞を誘導し、調節シグナルだけでなく、MSCでなく、造血前駆体およびnemezenhimalnye骨髄幹細胞を提供し、redshestvenniki間質微小環境を作成することを証明しています。造血に関与するMSCは造血を支持間質細胞に分化する能力、造血幹細胞から直接得られる、請求アクティブ案内MSK信号により測定することが知られています。ネットワーク間質前駆細胞の培養は、造血細胞の全てのクローンの供給のための基礎である理由です。

成熟血液細胞及び末梢における免疫系細胞の「支出」との動的平衡の状態で血液透析及びリンパ球の成熟生物強度。骨髄間質細胞とリンパ器官は、ほとんど更新しないので、大幅なリストラ間質構造は、それらの中には発生しません。動的平衡のシステムを持参間質構造が破損して臓器だけではなくではなく、造血またはリンパ系細胞のそれほど影響を与え、順次変更の同じタイプにつながるあらゆる臓器HEMOまたはリンパ球への機械的損傷、の助けを借りて可能です。修復再生の過程において、主に、次いで造血または免疫細胞を再増殖間質枠組みを形成しました。この長い知られている事実は、血液形成器官の間質微小環境を研究するための外傷後の再生の便利なモデルになります。迅速かつ効果的に動的平衡の状態から造血組織を持参することができ、掻爬 - 特に、骨髄の修復再生の調査のために長骨の骨髄腔を空力学的に使用されます。脛骨モルモットの髄腔の機械的空にした後、造血および間質骨髄成分の修復再生のプロセスを研究する際には、造血及び間質細胞（造血細胞の数、間質前駆細胞の濃度及び量）の指標の再生の間には直接的な相関関係が存在しないことを見出しました。また、それは、間質前駆細胞の人口の増加は掻爬後に以前の日付で発生することが判明した、と自分自身間質性線維芽細胞は、骨形成の組織の特徴である、fosfatazopolozhitelnymiです。また、掻爬3-5長い骨がモルモットにのみリンパ球体であっても、脾臓における骨髄中の細胞集団の成長と非操作骨につながることが立証されました。

骨髄kyuretirovannyh脛骨モルモットにおける形態学的画像修復のプロセスは、一般的に他の種の動物での実験で得られた文献データに対応し、造血組織の除去後に起こっている変化のダイナミクスは、すべての種で同じであるとの違いは、唯一の時間パラメータに関する。形態学的に髄腔に造血を回復するための位相手順はさらに、造血要素を再増殖正弦波と網状形成間質の血餅形成粗い繊維の骨、その吸収を、組織の連続したプロセスで空にされます。造血幹細胞の含有量に平行増加骨髄組織再生プロセス増加中の造血前駆細胞の数。

Gerasimov Yuら（2001）は、造血細胞の数および再生プロセスの個々の段階での間質細胞前駆体の量の変化を比較しました。これは、骨kyuretirovannoyにおける骨髄細胞の量的変化は、形態学的再生特性のダイナミクスと一致することが判明しました。再生成著者のセルの内容の最初の3日間の減少は、網状組織が焦点の類骨と掻爬と血管損傷を形成するために、骨端の残りの骨髄で、後者で育つ作成微小環境の悪影響への造血細胞の損失を属性。7-12日目上昇yaderosoderzhaschih細胞は骨髄造血間質細胞増殖ゾーンにおける個々の病巣の出現と一致しています。20日に総細胞数の大幅な増加を伴う再生し、骨髄とよく発達洞のかなりの部分があります。しかし、この期間における造血要素の数は対照レベルの68％である。これは、掻爬後の造血細胞の数は唯一の35〜40日の動作後の基準に達したことを示す以前に公開されたデータと一致しています。

早期外傷後期において、造血の修復のための主な細胞源は、掻爬部に保存された細胞要素である。後の用語では、骨髄造血組織の再生の主な源は、幹細胞であり、自由な間質領域を再増殖させる。間質細胞（内皮、網状および骨形成）の特定のカテゴリーに関しては、髄腔の再構築中にそれらの形成を提供する供給源は説明できないままである。Yu.V.の結果 Gerasimovおよび共同研究者（2001）は、掻爬後に保存された骨髄において、線維芽細胞コロニーを形成する細胞の濃度が、正常な骨髄よりも有意に高いことを証言する。著者は、掻爬と造血細胞のより強い選択的溶出があると信じているとして、間質コロニー間質の形成に関与し、より強固造血細胞よりもその基本的な物質に接続されたセルを形成するとの比較します。

コロニー繊維芽細胞を形成する細胞数の変化のダイナミクスは、骨形成プロセスの強度造血細胞を移入し、その後の小柱骨吸収と形成網状間質と相関します。間質前駆細胞の大部分は、示された再生時間で粗繊維状骨組織および網状間質を形成する。再生ゾーンにおける5日の長期骨接合の条件における大腿骨の骨折のためにそれらの数が6倍に増加された集中中の細胞の濃度及びコロニー形成の線維芽細胞の数、及び骨形成を増加させます。線維芽細胞コロニーを形成する骨髄細胞は骨形成特性を有することが知られている。間質前駆細胞の数は、造血細胞による皮質骨髄の領域のコロニー形成の前に増加する。これは、間質細胞が造血微環境の形成をもたらすという証拠とよく一致している。明らかに、造血微小環境の作成は、間質組織の再生の特定のレベルに対応し、造血に適した拡張間質ブリッジ時造血細胞の数を増加させます。

最も興味深いのは、掻爬直後に、骨格の遠隔部分の間質前駆細胞の数が増加するという著者のデータである。第六時間から出発し、そして反対脛骨を含む二十日までに2倍以上の濃度の増加および線維芽細胞のコロニーを形成する細胞の数において観察されます。この現象のメカニズムは、おそらく同時に血小板の有意な数のコロニーを形成する細胞の増殖を引き起こすことが知られている血小板由来増殖因子（RBSK）への放出を破壊しながら、大規模な骨髄損傷が血餅の多数の形成をもたらすという事実と接続されています。増殖性プールの外側の体内に位置する線維芽細胞。ウサギにおける実験に局所投与MSCは導入されたMSC由来する軟骨細胞の形成に関連することができ、膝の外科的損傷軟骨の修復を促進します。しかしながら、実験室ラットにおける骨欠損の修復再生は、セラミック骨格に包まれた間葉系幹細胞の使用によって大きく増強される。したがって、我々はあなたがしなければないRBOKは、破損した間質細胞由来の他の要因が、骨髄の未使用領域における間葉系前駆細胞の増殖に遠くの刺激効果を持っており、欠陥骨髄組織の領域への移行を促進することを想定することができます。ターンでは、間質細胞は、造血細胞とは異なり、微小環境に責任があることを示す前の年の文献データ、この逆は移行し、ローカルのソースから来ることができません。

つまり、全身応答があるにもかかわらず、研究Gerasimov Yuら（2001）の結果は、機械的外傷のアプリケーションがkyuretirovannoy骨の間質組織の急激なリストラでなく、無傷で間質遠隔骨に大きな変化だけでなく、の原因となることを示唆しています局所的な外傷のための間質組織。複数掻爬 - - 多発性外傷を適用した場合と、この反応を増幅し、作動骨及び骨格の離れた部分にだけでなく、リンパ器官、特に脾臓だけでなく観察されます。骨髄間質組織および脾臓の局所的な外傷および多発性外傷に対するこのような全身応答のメカニズムは未知のままである。このプロセスは、骨髄の髄腔の間葉質間質によって放出される体液性因子の効果に関連すると考えられる。細胞増殖を担う骨髄間質細胞および脾臓organonespetsificheskogo液性因子を製造する可能性、コロニー形成線維芽細胞は骨髄の単層培養において活性を刺激するそれらのコロニーについてのデータを示します。

これに関して、それらの誘導体、骨髄だけでなく、他の組織だけでなく、再増殖全身多能性間葉系前駆細胞を投与された場合、それは、遺伝子治療のために、特に、使用されることは注目に値します。9ヶ月間、変異型コラーゲン遺伝子Iドナー細胞と野生型マウスのゲノムとMSCの大量の静脈内投与後に、レシピエントの骨および軟骨組織中の細胞の30％までを置き換える、およびトランスフェクトされた間葉系幹マウス細胞は、IL-3、ヒトを分泌することが示されています効果的に免疫不全マウスにヒト造血幹細胞との同時投与の場合には造血を支援します。

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間葉系幹細胞の遺伝的修飾

遺伝的改変の追加の実験成功は、移植後8週間にわたって血液抗血友病B因子における出現につながるセルの転送に続いてヒトMSCにおけるMSCのトランスフェクション第IX因子遺伝子免疫不全マウスをトランスフェに、注意すべきです。この実験では、γ-グルタミルカルボキシラーゼによる第IX因子の翻訳後修飾を、トランスフェクトされた細胞で行った。レトロウイルスベクターをコードするヒト因子IXを有するMSCの形質導入は、あまり成功している - わずか12日間、通常の強度凝固止血をサポートする第IX因子の治療レベルにおける血友病のイヌと、これらの細胞のその後の導入。

間葉系幹細胞の動物の脳実質への移植は、ニューロンおよびグリアの集団の両方においてドナー未成熟細胞が形質転換されることを示している。移植神経デリバティブ健康なドナーの間葉系組織は、理論的にはゴーシェ病や脂質代謝、炭水化物またはガングリオシドの他の疾患を有する患者で脳代謝の遺伝的異常の補正を可能にします。

神経や肝臓組織における骨髄間質前駆細胞における幹細胞の実験的な検索条件の転換を継続。研究者の注意は、分化インデューサーと特殊コンディショニング培地の組み合わせに焦点を当てています。具体的には、10％ウシ胎児血清、DMEM / F12培地（1/1）で洗浄し、再懸濁した骨髄間質細胞と初代培養を単離200,000 / cm 2の密度で播種します。24時間後、非接着細胞を除去し、取り付けられたプラスチック繊維芽細胞へ週間培養されます。一次マウス胚線維芽細胞の3日間の培養を培養して得られた馴化培地を使用した神経芽細胞への骨髄間質細胞の分化のために、ならびに2％のウシ胎児血清を含むDMEM / F12（1/1）の間でおよび20 ng / mlまたは10 -6 MのLiFを補充レチノイン酸（マウス胚性幹細胞およびヒトの神経分化に適用されるneyroinduktory）。肝細胞への前駆細胞への骨髄間質細胞の分化培地、10％ウシ胎児血清を補充したDMEM / F12（1/1）でマウス胎児肝細胞の初代培養を培養し、三日間の結果として作成された空調環境を誘発しました。

ここでもまた、骨髄間質のコロニー形成細胞は異型であり、2つのタイプに分けることができることに再度注目すべきである。第1のタイプは、大きな核および1つまたは2つの核小体を有する糸状仮足細胞を形成する線維芽細胞様細胞を含む。第2のタイプは、紡錘形形状の小さなセルによって表される。初代マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で得られた馴化培地中の両方のタイプの細胞の培養において、神経芽細胞と同様の細胞が培養の3日目および4日目に現れる。この段階で、彼らはしばしば糸状虫で終わる1つまたは2つの長いプロセスを有する紡錘形の形態を有する。短い樹状突起を有する錐体細胞または星状細胞はあまり一般的ではない。デンドライト成長が起こるを通して異なる成長円錐の糸状仮足と - デンドライト1つの神経芽細胞は、典型的な拡張（腎臓成長）とその遠位部、他方に分岐を有します。ニューロンに分化する神経芽細胞に固有の形態学的徴候（フィロポディアによる腎臓および錐体）は、神経発生に関する研究で詳細に記載されている。これに基づいて、いくつかの著者は、それらが培養で検出する細胞は神経芽細胞であると結論づけている。具体的には、すべてのZ-と、4日馴化培地に交換可能で2週間培養した間質細胞の初代培養後Schegelskaya E.ら（2002）は、未分化状態を維持し、増殖している細胞の一部を発見しました。外向きに、そのような細胞は線維芽細胞のように見え、分化している神経芽細胞と共に培養で同定された。ほとんどの細胞（約80％）は、神経組織の細胞への分化の異なる段階にあり、主にニューロンに分化していた。これらの細胞の樹状突起は互いに密接に接触し、その結果、細胞は徐々に長い多細胞鎖の形態で神経回路網の基質部分に形成された。神経芽細胞の樹状突起は、ニューロン自体の体の長さよりも8〜10倍長く、長く成長した。ピラミッド型細胞と星状細胞の割合が徐々に増加した。星状細胞の樹状突起は分岐した。著者らによると、ピラミッド型細胞と星状細胞の後の分化は、紡錘形型と比較して、動物における正常な神経発生の段階の配列に相当する。その結果、著者は、骨髄間質細胞の幹細胞が神経細胞のすべての3つの主要なタイプから体外に生成神経芽細胞内のどの過程で誘発される神経新生を露出させる。結論します 2％胎児血清および20ng / ml LIFを含む培地中で骨髄間質細胞を3〜4日間培養する間に、神経細胞の先祖も検出された。しかし、この場合、幹細胞は非常にゆっくりと分けられ、神経芽細胞の分化は30％の症例でしか起こらず、神経回路網を形成しなかった。神経細胞分化誘導因子、レチノイン酸として使用して、グリア細胞の優勢を持つ神経細胞の25~30％までの培養で得られた著者 - アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト。ニューロンは、紡錘形、ピラミッド形、星状細胞の3種類すべてで表されていましたが、すべての神経細胞のわずか3分の1を占めていました。錐体ニューロンの個々の軸索は、通常のneuroontogenesisに樹状突起の後の形成が現れることが判明している間、レチノイン酸媒体神経細胞をストローマ細胞の培養6日目に、より差別化になりました。著者らによれば、神経細胞の低い収率にもかかわらず、レチノイン酸を誘導する方法は、利点を有する：アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトおよび髄鞘形成は軸索と樹状突起の成長中に供給機能を動作させると正常神経組織の形成のために必要です。したがって、インビボで損傷した部位を修復するには、グリア細胞が豊富なニューロンの懸濁液を使用する方がよい。

第2の一連の実験では、著者らは骨髄間質細胞の肝細胞への分化を誘導しようと試みた。マウス胚性肝細胞を培養することによって得られた馴化培地における骨髄間質幹細胞の3日間培養した後、大規模な、球状の細胞は、異なるサイズの多くの場合、二核、細胞質封入体を発見されています。これらの細胞は分化の異なる段階にあり、大きさ、核の数および細胞質内の封入体の点で異なっていた。これらの細胞のほとんどでは、我々は肝細胞の前駆細胞としてそれらを特定したことにより、グリコーゲンを、検出されました。培養ためない細胞は、胚性肝細胞を培養して得られる馴化培地中で、神経細胞の分化のない要因がないと、逆に、肝細胞の前駆細胞への骨髄間質細胞の分化を誘導する因子が存在するという結論に続いて、神経芽細胞と同様に検出されませんでした。彼らは、特定の条件培地、およびインダクタに応じて、肝臓や神経組織の細胞にインビトロで分化として著者は、骨髄間質からの多能性細胞の存在を示唆しています。

いくつかの研究では、骨髄間質細胞の心筋細胞、軟骨、骨および神経組織細胞への分化が実際に正確に示されている。骨髄細胞には、肝細胞に分化することができる幹細胞の集団が存在するという情報がある。マウスにおける実験上、これらの結果に照らして、まだ成体生物の様々な組織の細胞に分化する能力を有する骨髄多能性間葉系幹細胞に存在する別の確認として考えることができます。

間葉系幹細胞の移植

ヒト間葉系幹細胞の臨床移植では造血幹細胞の拡大と彼らの初期の子孫のprekommitirovannyhのために使用することができます。ハイスピードにより、化学療法後の自家造血幹細胞およびMSCのがん患者の特定には、導入までの末梢血中の好中球および血小板の回復。自己および多発性骨髄腫、再生不良性貧血、自発的な血小板減少症治療するために使用される間葉系幹細胞の同種移植 - 一次欠陥造血間質組織に関連する疾患。上記の多くの場合、血液学的病態における細胞治療の効率、術後の回復期間の短縮を明らかに間質と造血幹細胞の導入、しばらく、血液、原因でダイと、自身の先祖造血患者の細胞非選択的に破壊する地域循環癌細胞に死亡者数の減少。骨髄吸引液を得るためのそれらの相対的な容易さ、治療用遺伝子の培養およびトランスフェクションの拡大に臨床診療におけるアプリケーションおよび他の多能間葉前駆細胞を約束したMSC。局所的な組織の欠陥は多能間葉前駆細胞および間葉起源の組織の全身性機能障害の局所的注入を使用することができるためしたがって全身循環への導入を排除するものではない補償します。

その引数地元、全身移植や遺伝子治療のためのMSCの視点は、生物学の間質細胞の観点から分析されている作品の作者でより慎重。実際には、造血組織およびそれに関連する支持間質 - 生後骨髄は、伝統的に異なる細胞株の二つの主なシステムからなる本体とみなされます。したがって、骨髄間葉系幹細胞は、もともとのみ調節因子の産生造血微小環境のための間質ベースの源とみなします。その後、研究者の注目は、骨格組織の幹細胞源としてのMSCの役割を研究することに転換した。最新のデータは、骨髄間質細胞の神経または筋肉組織の形成との予想外の潜在的可能性を示している。換言すれば、間葉系幹細胞はtransgermalnuyu可塑性を示す - 細胞型表現型非元の組織細胞に分化する能力を。しかし、骨髄間質細胞の生物学のいくつかの側面は、in vivo骨髄間質細胞ならびに許容可能性分化のex vivoおよび可能性の身分、自然、起源と発展および機能を含む、一般的な生物学的な計画であり、いくつかの詳細には不明と未解決のままin vivoでの治療的使用。MSCの潜在的な機会に関するデータ、ならびに生物学の確立教義と鋭い対照的に、幹細胞の他の再生可能性の研究の結果。

低密度条件下で培養すると、骨髄幹間質細胞は異なるコロニーを形成し、その各々は単一の前駆細胞の派生物である。大幅にコロニーを形成するそれらの能力によって定義された骨髄有核細胞における間質細胞前駆体の割合は、培養条件や所属MSCの種に依存します。ヒト間葉系幹細胞のコロニー形成効率がフィーダから独立している、または培養培地からながら、例えば、間質前駆細胞の最大量を得るために、齧歯類において、骨髄細胞、血清の照射フィーダー培養物の存在下で絶対に必要です。間質前駆細胞の増殖を刺激する既知の分裂促進因子の数は限られている。これらには、PDGF、EGF、FGF、TGF-b、およびIGF1が含まれる。最適条件下で、吸引1mlのそれから骨髄間質細胞の数十億を受信することができる50回の以上の細胞分裂、インビトロで維持のMSCポリクローナル株を培養します。

しかし、骨髄間質細胞の集団は、コロニー、異なるそれらの形成の速度および大型フラット細胞への線維芽細胞様スピンドルの範囲を含む細胞形態の種々の大きさの変動として現れ、不均一です。このような作物が20日後に発生すると、表現型の異質性も認められる。いくつかのコロニーは、アルカリホスファターゼによって高度に発現され、他のコロニーは、全くそれを発現せず、第3のタイプのコロニーは、中央領域ではホスファターゼ陽性であり、周辺ではホスファターゼ陰性である。別個のコロニーが骨組織の小結節を形成する（アリザリンレッドで染色された場合、またはVan-Kossによってカルシウムで染色された場合、マトリックスの石灰化の始まりがマークされる）。他のコロニーでは、脂肪蓄積が起こり、赤色の油でG染色することによって同定される。間葉系幹細胞のコロニーは、青色で着色した軟骨を形成することは少ない。

実験動物における異所性移植後ポリクローナルMGK線は軟骨組織でも、まれに、骨髄造血および脂肪細胞に関連したsetchatoobraznoyと異所性骨基質を形成しません。造血及び血管系の細胞株は、レシピエント由来であるのに対し、新たに形成された骨組織が骨細胞で構成されている、請求がある場合キメリズムに骨髄間質細胞のモノクローナル線移植において、脂肪細胞は、間質およびドナー起源を含みます。

これらの研究の結果は、クローンラインが得られた間質骨髄前駆体の幹の性質を確認する。彼らは同時に、培養細胞におけるクローニングのすべてが実際に多能性幹細胞であるとは限らないことも示している。個々のクローンの分化の本当の可能性についての最も正確な情報のみを移植した後ではなく、in vitroでのその誘導体の表現型を決定することにより、生体内で得られることが、一部の研究者は信じている、と我々は彼らの意見を共有しています。（mRNAによって、または組織化学的技術を介して決定される）hondro-又は脂肪生成骨関節炎培養表現型マーカーの発現、さらには鉱化マトリックスの産生は、インビボで多能性単一クローン性の程度を反映していません。したがって、間質細胞群における幹細胞の同定は、生物学的移植試験の適切な条件のもとで、事後的にのみ可能である。局所的低酸素張力を達成し、前記軟骨の形成は、このような拡散チャンバーとして閉鎖系、またはin vitroでの間質細胞のmikromassnyh培養では珍しいことではないのに対して、特に、非常にまれ軟骨の形成に寄与し、移植オープンシステムでは観察されなかっ軟骨。したがって、移植技術および非特異的なインビトロ培養条件でさえ、MSC分化の範囲に有意に影響を及ぼす。

所与の実験条件の遵守による実験的移植は、骨髄間質細胞の分化の可能性およびそれらの適切な同定の重要な要素を決定するためのゴールデンスタンダードである。歴史的に、骨髄間質性骨髄移植の研究は、一般的な骨髄移植の問題に関連している。造血微小環境は、骨髄間質細胞の移植によって作製され、移植ゾーンにおける造血組織の異所性発達を提供することが確立された。宿主由来のドナーおよび造血組織からの微環境の起源は、異所性骨を真の「逆位」骨髄移植として治療することを可能にする。骨髄間質細胞の局所移植は、骨欠損の効果的な矯正を促進し、自発的修復再生よりも顕著である。動物モデルでのいくつかの前臨床試験では説得力の最も単純な例では、これらの方法を最適化することが、整形外科での骨髄間質細胞の移植の可能性を証明し、最も丁寧な仕事と分析を必要とします。特に、エクスビボでの骨形成間質細胞の増殖のための最適条件はまだ確立されておらず、理想的な担体の構造および組成は、バルク骨再生に必要な細胞の数と同様に未使用のままである。

間葉起源の非正統的な延性MSCの組織再生のために伝播ex vivoで骨髄間質細胞を適用することに加えて、神経細胞の再生のための潜在的な使用、またはCNSにおける遺伝子産物の配信を開きます。原則として、これは、ヒトから自己神経幹細胞を得る必要がないので、神経系の敗北における細胞療法を単純化する。心筋細胞および筋原性前駆細胞の生成のために骨髄細胞を真の間質および外因性起源として使用する可能性について報告されている。

一般的な骨格疾患の治療のための骨髄間質細胞の全身移植に関する実験が行われている。骨髄間質細胞がうまく実験動物における病理学的な骨組織の形成につながる細胞の遺伝情報を用いることによりベクター導入によって示されている骨格の疾患における遺伝性疾患、責任集団であることは疑いありません。しかしながら、一般的な血流に導入された後の骨格の骨において、間質細胞が移植、増殖、増殖、分化する能力はまだ証明されていない。

これは、部分的に骨髄間質の標準的な手順は、造血組織、その全身間質細胞を投与するのに成功した生着を評価するための厳格な基準はまだ開発する必要が移植されていないという事実にあります。それだけで、それらの生存について、ドナー由来細胞の培養における組織抽出物または放出におけるマーカー遺伝子の存在は、細胞の生着しないように証明することを忘れてはなりません。マウスの四肢における骨髄間質細胞のさえ、動脈内注射は、ドナー由来の細胞は微小血管骨髄ネットワーク内で大量に発見されたという事実にもかかわらず、実質的にゼロ結果の生着につながることができます。残念なことに、このような細胞は、エクスビボ培養条件下でのマーカードナー遺伝子の決定の結果に基づいてのみ、「移植された」と通常説明される。さらに、ドナー起源の分化し機能的に活性な細胞の組織における長期間の統合の説得力のある証拠を提供することが必要である。スケルトンに骨髄間質細胞の生着を報告する多くの出版された作品では、それが顕著であるこの種の明確なデータが存在しないことです。それにもかかわらず、動物に対するいくつかの正確な実験では、全身投与後の間質前駆細胞の限られたしかし実際の移植が確立されていることに留意すべきである。

これらのデータは、脈管系を介して筋原線維性骨髄前駆細胞を筋肉に送達する可能性の研究の結果と一致する。しかし、骨格筋組織と筋肉組織の両方が、血液中の循環を伴わない移動プロセスを使用する血管外細胞移動に基づいて発生および成長中に形成されることを忘れてはならない。前駆細胞を固相組織に送達するための独立した循環経路が実際に存在する場合、生理学的に循環する間葉前駆細胞の存在を可能にすることができるか？発達中および出生後の生物の両方でこれらの細胞の起源は何ですか？それらは血管壁にどのように浸透しますか？これらの問題の解決は絶対に必要であり、最も完全な前臨床分析が必要です。これらの質問に対する答えが見出された後でさえ、骨格の成長および結合組織の再構築に関連する問題のある動態的側面は未解決のままである。同時に、突然変異した骨格前駆細胞の全集団を健康な間質細胞で置き換えることによる骨形成障害の治療は、実際の臨床的視点であるようである。この場合、インビトロ間質幹細胞を培養することにより、病理学的骨形成による骨折または変形の局所的領域ならびに骨組織の破壊的変化を補正することができる。したがって、将来の研究の方向性は、ex vivoでの自己変異骨形成前駆細胞の形質転換または遺伝子矯正の問題に焦点を当てるべきである。

細胞の遺伝子工学は、一時的または恒久的に、体外物質およびin vivoでの細胞代謝における個々のタンパク質の役割に関する多くの科学的な知見のソースセルと分子生物学の基礎となりました。間質性骨髄幹細胞の性質は、骨格の遺伝病の補正のためのユニークな回路移植を開発することができので、遺伝性疾患およびヒト疾患を修正するための分子技術の使用は、実用的な医療のための非常に有望です。この場合は、間葉系前駆細胞が将来の受信者から非常に簡単に得ることができ、彼らは遺伝子操作に適していると短時間に大量に繁殖することができます。間葉系幹細胞の使用は、直接vrtrusnyeベクター構築を通して患者の遺伝情報物質の送達に関連した制限やリスクを回避できます。それらの投与が可能な免疫学的移植後の合併症を除くために好ましい材料 - この戦略は、PI胚性幹細胞が、出生後の自己骨髄間質細胞に適用されます。短期的効果を達成するために、骨の再生を促進するために、例えば、最適な方法はelektroporatsrsh、化学的融合、リポフェクション、プラスミド及びアデノウイルス構築物を用いて間葉系幹細胞の遺伝子改変です。具体的には、骨髄間質細胞をBMP-2のウイルスのトランスフェクションは、実験的多発性外傷、骨の再生を促進するのに有効でした。毒性がないため、アデノウイルスベクター構造の作製が好ましい。しかしながら、この場合の骨髄間質細胞の遺伝子改変は、極めて低い安定性によって特徴付けられる。また、通常の形質転換された骨髄間質細胞が有意にトランスフェクトされた細胞死の割合を増加させる他の細胞型よりも10倍以上感染遺伝情報のベクトルキャリアの使用を必要とします。

特定の遺伝子アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノレトロウイルスキメラの使用を必要とする間葉系幹細胞の必要な長期または永久変形、低またはゼロの生物学的活性によって引き起こされる劣性疾患を治療します。これらのウイルスの輸送部位は、大きなDNAトランスフェクション（最大8kb）を運ぶことができる。IL-3、CD2、第VIII因子、およびL-DOPAの合成に関与する酵素 - 科学文献は、既にレトロウイルス調節分子の合成をコードする構築物、およびマーカーでトランスフェクトした外因性骨髄間質細胞の生物学的活性に関する情報が登場しています。しかし、これらの研究では、この技術の実際的な応用が始まる前に克服しなければならない多くの限界を指摘している。第1の問題は、MCK ex vivo修飾プロセスを最適化することである。骨髄の間質細胞のインビトロでの増殖における長期（3-4週間）は、そのトランスフェクト低下することが知られています。同時に、MSCの高レベルの遺伝子改変を達成するためには、数回の輸血サイクルが必要である。第2の問題は、まだ4ヶ月を超えない治療遺伝子の発現期間に関連する。有効な遺伝子発現の自然減少は、プロモーターの不活性化および改変された細胞の死に起因する。一般的な見通しでは予備調査の間葉系幹細胞の結果を使用して、遺伝情報の伝達は、右方向への生物学的活性を調節する、適切なプロモーターを選択し、ex vivoでトランスフェクション法のさらなる最適化の必要性を示し、自己再生、移植後にインビボでの修正骨髄間質細胞の能力を高めます。所望の方向に骨髄間質細胞の改変のためのレトロウイルス構築物の使用は、常に彼らの必須移植を必要としないことに留意すべきです。トランスフェクトされた間葉系幹細胞は、アクティブな物理的組込みを必要と結合組織で機能せずに安定しており、住宅の背景に補正機能を実行することができます。この場合、彼らは生体内の要因で生産、生物学的ミニポンプとみなすべきである、の欠如は、遺伝病の症状を決定します。

この場合には、歪んだ遺伝情報の移転または販売を阻止する必要があるので、遺伝子または異常な病理学的生物学的活性の発現によって特徴付けられる優性遺伝病の治療のための形質転換された骨髄間質細胞の使用は、はるかに問題があります。遺伝子工学の方法の1つは、トランスジェニック動物を作製するための胚性幹細胞の相同組換えである。しかし、そのような組換え体の同定、分離および拡張の問題と組み合わせる相同組換え体の非常に低いレベルが、でも新しい技術の方法の開発ならば、近い将来にこの技術の普及を促進することはほとんどありません。遺伝的変異が、所望の配列（短いDNAオリゴヌクレオチド、またはキメラRNA / DNAオリゴヌクレオチド）損傷ゲノムにおける同族体に結合する外因性DNAを導入することによって補正することができるように、遺伝子治療への第2のアプローチは、損傷を受けたDNAの支配的な病理自動補正に基づいています。第3の実施形態は、転写の可能性を排除三らせん構造を形成するために、特定の遺伝子に特異的に結合する特異的に設計されたオリゴヌクレオチドの使用によって達成される病理学的情報の伝送ロックを提供します。

ゲノムレベルでの遺伝病の補正が最適で好ましい治療方法であるが、mRNAはまた、ドミナントネガティブ遺伝子を遮断するための有望なベクター（おそらくより入手）です。翻訳及び/又は増加mRNAの分解を抑制するために長いタンパク質分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列または細胞のmRNAの生合成装置の結合の完全な遮断と一緒に使用されてきました。さらに、二本鎖RNAはmRNAの急速な分解を誘導し、その機構は不明確なままである。しかし、短いまたは単一変異を有する変異対立遺伝子から転写されたmRNAの単なる除去が正常な対立遺伝子のmRNA発現を促進することはほとんどありません。代替は、翻訳時にその切断および不活性化のその後の誘導とmRNAの非常に特異的な部位に結合する能力を持っている、使用ribozinovハンマーヘッドおよびヘアピンです。現在、この方法を病的骨形成の治療に使用する可能性が研究されている。かかわらず、正確に対象が何であるかの - 新しい遺伝子治療技術のゲノムまたは細胞質要素の成功骨髄間質細胞のex vivoで、特定のベクターとin vivoで所望の因子を発現する間葉系幹細胞の安定した能力の最適な選択における試薬の包含の効率によって決定されるであろう。

したがって、予期せぬ特性を有する間葉系幹細胞の発見は、細胞系の開発のための新しい概念的スキームを創出する。しかし、間質幹細胞の生物学的役割を理解することは、その性質のため、胚発生、出生後の成長、成熟と老化の過程で、並びにヒト疾患におけるそれらの生理学的重要性転換または脱分化する能力が、さらに学際的な研究が必要です。