結核の臨床検査診断
最後に見直したもの： 05.07.2025
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臨床血液検査
結核患者では、一般的な血液検査の変化は診断的ではありません。限定的および低活動性の結核では、正常数の赤血球の低色素症が特徴的です。広範囲の乾酪性リンパ節炎、特定の腸管損傷、および大量の肺出血または術後出血を伴う大規模な浸潤または乾酪性肺炎では、赤血球減少症および小赤血球症、乏色素症、多色素症が認められます。大赤血球症、特に変形赤血球症は、通常は重度の貧血を伴い、はるかにまれにしか見られません。結核の代償期における網状赤血球の数は0.1～0.6％、代償不全期では0.6～1.0％、代償不全期では1％の網状赤血球が特徴的です。
結核の症例によっては、中程度の白血球増多（白血球数 15,000 個まで）が観察される場合もありますが、それほど多くはありませんが、限定的かつ軽度の病状の患者では 2 ～ 7% の症例で白血球減少症が発生し、破壊的かつ進行性の肺結核では 12.5% の症例で発生します。
最も頻繁に見られるのは、白血球組成の変化です。相対的および絶対的な好中球増多が認められ、白血球組成は前骨髄球へと中程度に左にシフトします。合併症のない結核では、骨髄球はほとんど認められません。結核患者の血球像において、病的な顆粒状の好中球数の増加は、常に結核の進行過程を示しています。重症結核患者では、ほぼすべての好中球に病的な顆粒状の変化が見られます。結核の発症が治まると、核の変化は比較的速やかに正常に戻ります。好中球の病的な顆粒状変化は、通常、血球像における他の変化よりも長く持続します。
末梢血中の好酸球数も、病態の段階や病原体のアレルギー状態によって変動します。重症かつ遷延性の発病では好酸球数が減少して無好酸球症となり、逆に浸潤物や胸水の吸収、そして原発性結核の初期段階では好酸球数が増加することが知られています。
一次性結核のほとんどの形態はリンパ球減少症を伴い、特定の変化が瘢痕化した後も数年間観察されることがあります。二次性結核の急性期では、病状の重症度に応じて、リンパ球数が正常となる場合もあれば、リンパ球減少症を伴う場合もあります。
結核のプロセスを評価する検査の中で、赤血球沈降速度（ESR）の測定は特別な位置を占めており、これは結核のプロセスの経過を評価し、その活動形態を特定する上で重要です。ESRの上昇は病理学的プロセス（感染性および炎症性、化膿性、敗血症性、血芽球症、リンパ肉芽腫症など）の存在を示し、その重症度の指標として機能しますが、正常なESR値は必ずしも病理学的プロセスがないことを示すものではありません。赤血球沈降の促進は、血液中のグロブリン、フィブリノーゲン、コレステロールの含有量の増加と血液粘度の低下によって促進されます。赤血球沈降の遅延は、血液濃縮、アルブミンおよび胆汁酸の含有量の増加を伴う状態の特徴です。
結核患者の血液像は治療中に変化します。治療介入が成功すればするほど、血液学的変化はより早く消失します。同時に、様々な抗菌薬が造血に及ぼす影響にも留意する必要があります。抗菌薬はしばしば好酸球増多症を引き起こし、場合によっては白血球増多症、そしてより一般的には無顆粒球症やリンパ網様反応に至る白血球減少症を引き起こします。患者の臨床状態、治療過程の動態、そして治療の有効性を評価するためには、体系的な血液学的モニタリングと得られたデータの正確な分析が不可欠です。
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臨床尿検査
尿路結核の場合、尿検査が主な臨床検査法です。白血球尿、赤血球尿、タンパク尿、低張尿、結核性抗酸菌尿、非特異的細菌尿などが観察されます。
白血球尿は、特異的化学療法前の尿路結核において最もよくみられる症状であり、尿管腔の完全閉塞などの例外的な場合にのみ認められます。ネチポレンコ試験（尿1ml中の白血球数を測定する試験）は、腎結核における白血球尿の程度をより客観的に評価するのに役立ち、場合によっては通常の一般尿検査で白血球尿を検出できることもあります。ただし、白血球尿は急性および慢性の腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、腎結石、尿管結石でも発生する可能性があることに留意する必要があります。
赤血球尿は白血球尿と同様に、泌尿生殖器結核の最も一般的な臨床検査所見の一つと考えられています。血尿の頻度は結核の蔓延状況に依存し、腎臓における結核性の破壊過程が進行するにつれて増加します。白血球尿を伴わない赤血球尿は、腎結核の初期段階でより典型的です。白血球尿よりも血尿が優勢であることは、非特異的腎盂腎炎との鑑別において、腎結核を支持する重要な論拠となります。
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生化学血液検査
結核において、いくつかの生化学的指標の変化は、主に病期、合併症、および様々な併発疾患に依存します。肺やその他の臓器の非活動性結核患者では、血清中の総タンパク質およびタンパク質分画は変化せず、正常範囲を決定します。
結核の急性型、および慢性型の結核の悪化と進行においては、アルブミングロブリン係数は低下します。
結核およびその合併症における肝臓の機能状態と器質的障害を評価する上で、血清中の直接ビリルビン、総ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の測定は非常に重要です。アミノトランスフェラーゼ値の動態測定。結核患者、特に重症患者の治療において、ビリルビン値は結核患者の生化学検査の必須項目であり、毎月実施されます。
腎臓の機能状態の評価には、血清クレアチニン値の測定とコッククロフト・ゴルト式を用いた糸球体濾過率の算出が含まれます。レベルグ試験を用いた糸球体濾過率の算出では、精度は低くなります。
結核患者の動的生化学研究の主な目的は、病状の経過を監視し、薬物の副作用を適時に検出し、発生する恒常性障害を適切に修正することです。
肺外結核における生化学的研究方法の応用
最も有益な指標は、生体液中の結核ステアリン酸の含有量であると考えられていますが、その測定には技術的な困難が伴います（ガスクロマトグラフィーと質量分析法を使用する必要がある）。
アデノシンデアミナーゼ活性の測定は有望です。アデノシンデアミナーゼは、滑液、心膜液、腹水、脳脊髄液などの体液中に検出される酵素です。アデノシンデアミナーゼの主な産生細胞はリンパ球と単球です。体液中のアデノシンデアミナーゼ活性の測定は、結核性滑膜炎、リンパ節結核、結核性髄膜炎、結核性漿膜炎の診断に役立ちます。
一部の生化学的指標は、その非特異性のため、病変近傍の体液でのみ測定されます。これらの指標値は、ツベルクリンを皮下または皮内に投与した際の反応として測定されます（通常は投与前、投与後48時間および72時間）。その後、マーカー値の増加率（％）を初期値と比較して算出します。
臓器特異的酵素であるトランスアミジナーゼの活性は、尿中で測定するのが最適であり、様々な原因による腎障害においてその出現が認められます。トランスアミジナーゼの検査は、局所炎症過程を悪化させるためにツベルクリンを皮下投与する場合にのみ正当化されます。トランスアミジナーゼ活性は、ツベルクリン50TEを投与後、投与開始時および24～72時間後に尿中で測定します。発酵尿が2倍以上増加した場合、82%の症例で活動性腎結核と慢性腎盂腎炎の悪化を鑑別できます。
女性生殖器の結核の場合、血液中のハプトグロビンおよびマロンジアルデヒドの濃度を、誘発性ツベルクリン試験の条件下で測定します。ツベルクリンを50 TEの用量で皮下投与し、72時間後に再度生化学検査を実施します。結核性病因の場合、ハプトグロビンレベルの増加率は少なくとも28％、マロンジアルデヒドレベルは39％以上です。ダグラス窩から採取した腹水中のアデノシンデアミナーゼ活性の測定も使用されます。前腹壁の内生殖器の投影領域に、ツベルクリンを0.1 TEおよび0.01 TEの用量で皮内投与してから72時間後に、穿刺を再度検査します。アデノシンデアミナーゼの活性が初期値と比較して 10% 以上増加すると、結核性プロセスが示唆されます。
眼損傷の場合、抗原刺激に対する眼の局所反応を検査します。この場合、視覚機能の低下を伴う鋭敏な反応の発現は望ましくありません。微小な局所反応の評価は困難な場合が多いため、結論を客観化するために、血清中のハプトグロビンまたはアデノシンデアミナーゼの上昇度合いにも並行して注目することが推奨されます。
すべての生化学的研究は他の方法と組み合わせて実施する必要があります。
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血液凝固系の研究
結核学において血液凝固系の状態を研究することの重要性は、多くの肺結核患者に喀血や肺出血が認められること、そして結核の外科治療において血液凝固合併症が発生することにあります。さらに、自然発症的に生じる潜在的な血管内血液凝固は、病気の経過や化学療法の効果に影響を及ぼします。
滲出性炎症が優勢な肺結核患者では、血液の抗凝固活性の低下が観察されます。産生性炎症が優勢で、特異的肺損傷の有病率が低い患者では、血管内血液凝固は軽微です。喀血および肺出血を伴う肺結核患者では、血液凝固系の状態は異なります。喀血のピーク時または喀血停止直後の少量の失血患者では、トロンビン形成過程が顕著に促進されるため、血液凝固能が急激に上昇しますが、「構造的」凝固能は維持されます。大量失血患者では、フィブリノーゲン濃度、第XIII因子活性、および血小板数の低下により、凝固能が低下します。限定的な肺結核患者における外科的治療の段階では、恒常性維持システムに重大な障害は発生しません。広範囲に及ぶ病変を有する患者では、肺全摘出術または胸膜肺全摘出術を行う際に、DIC症候群を発症することが多く、これは「二次疾患」として現れることがあります。
肺結核患者の血液凝固系の状態を監視するには、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）、フィブリノーゲン、トロンビン時間、プロトロンビン指数、出血時間、血液凝固時間を測定する必要があります。
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ホルモン研究
現代の実験的および臨床的観察は、肺の特定の結核性炎症においてホルモン状態の変化が存在することを示しています。抗結核療法と組み合わせた下垂体-副腎系、下垂体-甲状腺系、および膵臓機能の障害の改善は、特定の炎症部位における線維形成および修復プロセスの活性化に寄与することが証明されています。
下垂体甲状腺系の機能状態は、血清中のトリヨードチロニン（T3）、チロキシン（T4）、および下垂体甲状腺刺激ホルモン（TSH）の含有量によって判断されます。肺結核患者の38～45%に潜在性甲状腺機能低下症が認められ、播種性結核および線維性海綿状結核で最も多く診断されます。これらの結核では、T3とT4の両方の濃度が最も急激に低下し、これらのホルモンの不均衡がT4/ T3比の上昇という形で現れます。
副腎皮質機能は血清コルチゾール濃度によって評価され、膵臓の内分泌機能は免疫反応性インスリン濃度によって評価されます。感染症の急性期には、内因性コルチゾールとインスリンの必要量が増加します。高インスリン血症は、体組織のインスリン抵抗性も示しており、これはあらゆる活動性炎症プロセス、特に特定の炎症プロセスに典型的に見られます。活動性肺結核における副腎のグルココルチコイド機能の測定により、ほとんどの患者でコルチコイド機能亢進症の存在を検出することができます。急性期の感染性炎症患者における正常な血中コルチゾール濃度は、副腎皮質のグルココルチコイド機能の相対的な不足とみなすべきであり、これは適切な量のグルココルチコイドによる補充療法の根拠となり得ます。
肺結核患者の約3分の1は正常範囲の下限に近い低インスリン血症を示し、13～20%は著しい高インスリン血症を示します。相対的低インスリン血症および高インスリン血症は、重症度が異なる糖代謝障害の発症リスクの高い因子です。膵B細胞の機能活性におけるこれらの変化は、結核患者において定期的な血糖モニタリングと糖尿病の早期予防を必要とします。さらに、これは結核の複合治療において生理的インスリン投与量の適切性をさらに裏付けるものとなります。
一般的に、甲状腺ホルモンレベルの低下、その不均衡、高コルチゾール血症および高インスリン血症は、広範囲の肺病変と顕著な結核中毒の症状を伴う重度の結核過程の患者において最も顕著になります。
結核の微生物学的診断
微生物学的検査は、結核患者の特定、診断の確認、化学療法の監視と修正、治療結果の評価、つまり、結核患者が登録された瞬間から登録簿から削除されるまでの間、必要となります。
あらゆる疫学プログラムやプロジェクトは、細菌排泄者数の評価に基づいていますが、結核菌を検出するための検査法を用いることなく評価を行うことは不可能です。いわゆる非組織化集団全体を調べると、細菌排泄者の割合は70%以上に達し、この集団グループにおける結核患者を特定する上で、検査法は非常に有効な手段となります。
結核の診断における伝統的な微生物学的方法は、細菌鏡検査と培養検査です。現代的な方法としては、自動システムによる結核菌の培養やPCR検査などがあります。しかし、これらの方法はすべて、必然的に古典的な細菌学的方法と組み合わせる必要があります。
診断材料の収集
臨床検査の有効性は、診断材料の品質に大きく依存します。診断材料の収集、保管、輸送に関する規則の遵守、そして患者検査アルゴリズムの正確な実施は、結果に直接影響を及ぼし、生物学的安全性を確保します。
結核の検査には様々な材料が用いられます。肺結核は結核感染症の中で最も多くみられるため、主な検査材料は喀痰やその他の気管支分泌物、エアロゾル吸入後の上気道分泌物、気管支洗浄水、気管支肺胞洗浄液、気管支鏡検査、経気管生検、肺生検で得られた材料、気管支吸引液、喉頭塗抹標本、滲出液、創傷塗抹標本などです。
患者からの材料採取は、管理された方法で実施することで研究の有効性を高めます。そのためには、特別な設備を備えた部屋を用意するか、専用のブースを購入する必要があります。材料採取は危険な作業であるため、研究用の材料は感染安全規則を遵守して採取する必要があります。
結核菌の検査のための材料は、環境の汚染を防ぎ、収集された材料を汚染から守るために、しっかりとねじ込まれたキャップが付いた滅菌バイアルに収集されます。
診断材料を収集するためのバイアルは、次の要件を満たす必要があります。
- 耐衝撃性のある材料で作られていなければならない。
- オートクレーブ処理すると簡単に溶けるはずです。
- 十分な量（40～50 ml）であること
- 痰を採取するための広い開口部を有する（直径30mm以上）。
- 取り扱いが容易で、透明または半透明であり、蓋を開けずに採取したサンプルの量と品質を評価できる。
最適な研究結果を得るには、以下の条件を満たす必要があります。
- 化学療法の開始前に材料の収集を行う必要があります。
- 研究のための材料は、朝の食事や薬の服用前に採取する必要があります。
- この検査では、少なくとも3日間連続して朝の痰のサンプルを採取することをお勧めします。
- 収集された材料はできるだけ早く研究室に届けられなければなりません。
- 材料を直ちに研究室に搬送することが不可能な場合には、4℃の空気温度で冷蔵庫に48時間以内に保管される。
- 材料を輸送する際は、ボトルの完全性に特別な注意を払う必要があります。
正しく採取された痰は粘液性または粘液膿性の性質を示します。検査対象となる痰の最適な量は3～5mlです。
痰の採取は医療従事者の監督下で行われます。痰の採取責任者は、以下の規則を遵守する必要があります。
- 患者には、検査の目的と、唾液や鼻咽頭粘液ではなく、呼吸器の深部の内容物を吐き出す必要があることを説明することが必要です。これは、数回（2～3回）深呼吸した後に生じる湿性咳嗽によって達成できます。また、口腔内に繁殖している細菌叢の大部分と、喀痰検査を困難にする食物残渣を除去するために、まず熱湯で口をすすぐ必要があることを患者に伝える必要があります。
- 痰の採取に携わる医療従事者は、ガウンと帽子に加えて、マスク、ゴム手袋、ゴムエプロンを着用しなければなりません。
- 患者の後ろに立つ際は、できるだけボトルを唇に近づけ、痰を吐き出す際にすぐにボトルに痰を流し込むように指示されます。その際、空気の流れが医療従事者から遠ざかるようにする必要があります。
- 喀痰採取が完了したら、医療従事者はボトルの蓋を丁寧に閉め、採取した喀痰の量と質を評価します。その後、ボトルにラベルを貼り、専用の箱に入れて検査室へ搬送します。
患者が痰を出さない場合は、検体採取の前夜と当日の早朝に、去痰薬（マシュマロ根エキス（ムカルチン）、ブロムヘキシン、アンブロキソールなど）を投与するか、痰採取室に設置された機器を用いて刺激性の吸入剤を投与してください。このように採取された検体は保存せず、採取当日に検査する必要があります。検査室での「拒絶反応」を避けるため、紹介状には特別な注意書きを記載してください。
特定の施設で微生物学的検査が行われていない場合、採取された診断材料は、検査機関に中央から搬送されなければなりません。その際、材料は搬送間は冷蔵庫または防腐剤を用いて保管されます。材料は、容易に消毒できる輸送箱に入れて検査機関に搬送されます。各サンプルには適切なラベルを貼付し、バッチ全体について添付書類を記入する必要があります。
患者の検査方法と頻度
結核患者の初期、いわゆる診断検査では、医療従事者の監督下で 2 ～ 3 日間にわたって採取された痰の少なくとも 3 つの部分を検査する必要があり、これにより顕微鏡検査の有効性が高まります。
結核の一次スクリーニングは、保健医療システムに属するすべての医療機関および診断機関によって実施されるべきです。近年、一次検査の有効性を高めるため、臨床診断検査室を基盤として、最新の顕微鏡や防疫安全設備を備えたいわゆる顕微鏡センターが設立されました。
結核対策施設では、喀痰またはその他の診断材料を3日以内に少なくとも3回検査する検査計画を採用しています。治療中は、強化化学療法期に少なくとも月に1回、定期的に微生物学的検査を実施します。フォローアップ期に移行すると、検査の頻度は2～3ヶ月間隔に減り、検査の頻度は2回に減ります。
肺外結核の診断材料採取の特徴
肺外結核の病理学的材料の特徴は、その中の結核菌の濃度が低いことであり、そのためには、主に栄養培地に播種する方法など、より感度の高い微生物学的研究方法が必要になります。
泌尿生殖器結核の場合、尿は検査に最もアクセスしやすい材料です。尿の採取は、専門の訓練を受けた看護師が行う必要があります。
外性器は水と石鹸、または過マンガン酸カリウムの薄い溶液で洗います。尿道口は丁寧に処置します。朝の尿の中間部分は滅菌ボトルに採取します。男性の場合は当然、女性の場合はカテーテルを用いて採取します。腎盂からの尿は、片方または両方の腎臓にカテーテルを挿入する際に滅菌試験管に採取します。後者の場合は、必ずそれぞれの腎臓から別々に採取します。この尿の少量を遠心分離し、沈殿物を検査します。
男性の場合、精子、精巣穿刺液、前立腺分泌物を遠心分離して沈殿物を得ます。男性の性器領域の特定の部位に限局している場合、前立腺マッサージは結核菌を含む分泌物の排出を促進する可能性があります。
月経血は、吸引法またはカフカキャップを用いて女性から採取されます。採取された物質は、蒸留水で洗浄した後、遠心分離機にかけて赤血球を除去します。沈殿物を検査します。
子宮頸管からの分泌物は何らかの容器またはカフカキャップに集められ、つまり1〜2 mlの病理学的物質が蓄積されることが望ましいです。
腎臓、性器、生検、子宮内膜掻爬などの外科的処置で得られた材料は、均質化されます。そのためには、材料を滅菌乳鉢に入れ、滅菌ハサミでよく砕きます。得られた懸濁液に、材料の質量と同量の滅菌川砂を加え、次に等張塩化ナトリウム溶液0.5～1.0 mlを加え、等張塩化ナトリウム溶液（4～5 ml）を加えて、ドロドロになるまで粉砕します。その後、材料を1～1.5分間静置し、上清を検査します。
骨および関節の結核。滅菌注射器で採取した穿刺液（膿瘍からの膿）は滅菌容器に入れ、直ちに検査室に搬送する。滅菌ピペットを用いて、予め滅菌等張塩化ナトリウム溶液で湿らせた膿2～5mlを採取し、ビーズの入ったボトルに移し、さらに等張塩化ナトリウム溶液2～3mlを加える。ボトルをストッパーで閉め、シェーカーで8～10分間振盪する。均質化した懸濁液を検査する。
瘻孔型骨関節結核では、瘻孔から膿を採取します。多量の排泄物は直接試験管に採取します。排泄物が少ない場合は、瘻孔管を滅菌等張塩化ナトリウム溶液で洗浄し、試験管または膿に浸したタンポンに採取した洗浄液を検査に提出します。
骨や関節への外科的介入中に得られる手術材料には、化膿性壊死性腫瘤、肉芽、瘢痕組織、骨組織、滑膜組織、その他の基質が含まれる場合があります。その処理は腎結核の場合と同様に行われます。
凝固を防ぐために、穿刺後すぐに 3% クエン酸ナトリウム溶液 (1:1 の比率) で滑液の微生物学的検査を実施します。
リンパ節結核。リンパ節穿刺時に採取された膿は、膿瘍から採取された膿と同じ方法で検査されます。外科的介入や生検で採取されたリンパ節組織は、他の結核と同様に検査されます。
結核菌の糞便検査は、陽性結果がほとんど得られないため、極めて稀にしか行われません。
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結核菌の顕微鏡検査
喀痰顕微鏡検査は、比較的迅速、簡便、かつ安価な検査法であり、結核が疑われるすべての症例で実施すべきです。さらに、この検査は、化学療法の有効性を評価し、培養結果が得られない場合に回復または治療失敗を確認するために行われます。
顕微鏡検査には 2 つの方法が使用されます。
- 直接顕微鏡法、診断材料から直接塗抹標本を作製する。
- 文化研究のために除染剤で処理された材料から作成された堆積物の顕微鏡検査法。
最初の方法は、顕微鏡検査のみを実施する検査室（一般医療ネットワークの臨床診断検査室）で使用されます。
顕微鏡検査の最良の結果は、診断材料を濃縮することによって（たとえば、遠心分離によって）得られます。
顕微鏡検査で結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を50%の確率で検出するには、1mlの喀痰中に5,000個以上の微生物細胞が含まれている必要があります。肺結核患者の喀痰には通常、相当数の抗酸菌が含まれているため、細菌検査によって確実に検出できます。この方法の診断感度は、1人の患者から複数の喀痰検体を検査することで向上します。細菌検査の結果が陰性であっても、結核の診断を除外するものではありません。なぜなら、患者によっては、喀痰中の結核菌の数が顕微鏡検査で検出できる数よりも少ない場合があるからです。喀痰塗抹標本の調製が不十分であることも、細菌検査の結果が陰性となる原因となります。
塗抹標本中の抗酸菌を検出する最も一般的な方法は、ツィール・ニールゼン染色です。この方法は、ワックス脂質層を含む膜を通してカルボルフクシンが微生物細胞に浸透し、加熱とフェノールの強力なエッチング作用を同時に利用することに基づいています。その後、塗抹標本を25%硫酸溶液または3%塩酸アルコールで脱色すると、抗酸菌以外の組織がすべて脱色されます。脱色された塗抹標本の成分は、0.3%メチレンブルー溶液で染色されます。抗酸菌は従来のアニリン染料を感知しないため、抗酸菌はラズベリーレッドに、その他の微生物や細胞成分は青く染色されます。
ジール・ニールゼン染色法で染色した塗抹標本を検査するには、90倍または100倍の液浸対物レンズと7倍または10倍の接眼レンズを備えた光学双眼顕微鏡を使用します。100視野を検査しますが、これは塗抹標本中の単一の抗酸菌を検出するには十分です。この検査結果が陰性の場合は、確認のためにさらに200視野を検査することをお勧めします。検査結果は、検出された抗酸菌（AFB）の数とともに記録されます。
この方法に加えて、蛍光染色法は発光顕微鏡検査にも使用され、最良の結果を得ることができます。この方法を使用すると、顕微鏡検査の効率が10～15％向上します。結核菌を発光色素（オーラミン、ローダミンなど）で処理すると、これらの物質は微生物細胞のワックス状構造にも結合します。染色された細胞に励起光源（特定の紫外線スペクトル）を照射すると、黒または濃い緑色の背景にオレンジ色または明るい赤色に輝き始めます。可視画像の明るさとコントラストが高いため、顕微鏡全体の倍率を4～10倍に下げることができ、視野が広がり、標本の観察時間が短縮されます。これに加えて、被写界深度が大幅に深くなるため、検査の快適性が向上します。
蛍光顕微鏡を用いると、塗抹標本の同じ部分を観察するのにかかる時間は、ジール・ニールセン染色された塗抹標本の光学顕微鏡観察よりもはるかに短くなります。顕微鏡検査者が1日の作業中に約20～25個の塗抹標本を観察すると仮定すると、蛍光顕微鏡を用いることで、同時に60～80個以上の標本を検査することができます。経験豊富な顕微鏡検査者であれば、オーラミンとローダミンの混合物で細胞を染色することが、抗酸菌に特異的な染色法であることを知っています。この場合、抗酸菌は金色の桿体のような外観をしています。腐生菌は緑がかった色に染まります。
蛍光顕微鏡法のもう一つの重要な利点は、特に強力な化学療法などの多くの不利な要因の影響下で耐酸性特性を失い、そのためジール・ニールゼン染色では検出されない変化した結核菌を検出できることです。
蛍光顕微鏡法の欠点としては、顕微鏡とその運用コストが比較的高いことが挙げられます。しかし、集中管理された研究室や大規模な研究室では、従来の顕微鏡3台を3人の検査技師が操作する基準を超える作業負荷が発生するため、蛍光顕微鏡1台を使用する方がコストを抑えることができます。
細菌学的検査法は特異度がかなり高く（89～100%）、顕微鏡検査法で得られた陽性結果の約97%は、播種結果によって明確に確認されます。
病理学的材料の塗抹標本の顕微鏡検査では、検出された耐酸性結核菌の種を特定できないことに注意する必要があります。顕微鏡検査では、標本中に耐酸性微生物が存在するかどうかのみを判断できます。これは、自然界には結核群の耐酸性結核菌と形態学的に類似した非結核性微生物が多数存在することから説明されます。
顕微鏡検査結果の評価は半定量単位で実行されます。
異なる顕微鏡検査法の結果を比較するために、経験係数が導入されています。例えば、蛍光染色した塗抹標本の結果を光学顕微鏡検査（1000倍の倍率）のデータと比較するには、蛍光顕微鏡で検出された抗酸菌の数を対応する係数で割る必要があります。顕微鏡の倍率が250倍の場合は10、450倍の場合は4、630倍の場合は2です。
肺外結核における顕微鏡検査の特徴
直接顕微鏡検査に加え、Ziehl-Neelsen染色法または蛍光染色法を用いて増菌後、塗抹標本を作製し、顕微鏡検査を実施します。塗抹標本の直接顕微鏡検査は、材料中の結核菌濃度が低いため効果がなく、増菌法を用いる方が合理的です。最も効果的なのは遠心分離法です。生物学的材料が粘性がある場合は、遠心分離と同時に材料の均質化と液化を行います。これは、遠心力3000 gの高速遠心分離機と次亜塩素酸塩溶液を用いて行われます。マイクロフローテーションなどの他の増菌法は、生物学的に有害なエアロゾルの形成を防ぐため、現在使用されていません。
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結核診断のための培養法
播種法、あるいは培養法は、塗抹顕微鏡検査よりも感度が高く、塗抹顕微鏡検査に比べて多くの利点があります。検査対象物中に数十個の生菌を検出できるため、高い診断価値を有します。これは、少量の結核菌を排泄する新規診断または治療患者の検体を検査する場合に特に重要です。
顕微鏡検査と比較して、培養検査は結核患者の検出数を15～25%以上増加させるだけでなく、結核がまだ容易に治療可能な早期段階で診断することを可能にします。培養検査の非常に重要な利点は、病原体を培養し、薬剤感受性、毒性、その他の生物学的特性との関連で同定・研究できる可能性にあると考えられています。
栽培方法の欠点としては、期間が長い（材料の待機期間は 10 週間に達する）、コストが高い、診断材料の処理が複雑であるなどが挙げられます。
診断材料の播種前処理の原則
従来の微生物学的手法では結核検査を行うことができません。これは、結核菌の増殖が非常に遅く、臨床検体のほとんどに増殖の速い化膿性・腐敗性の微生物や真菌が含まれているためです。栄養豊富な培地でのこれらの急速な増殖は、結核菌の発育を妨げ、結核病原体の分離を妨げます。そのため、診断材料は播種前に前処理する必要があります。さらに、患者の呼吸器から放出された結核菌は通常、大量の粘液に囲まれているため、濃縮が困難です。この点から、痰などの類似材料は播種前に液化・除染する必要があります。
あらゆる洗剤および除染剤は、多かれ少なかれ結核菌に対して顕著な毒性作用を有します。処理の結果、最大90%の結核菌が死滅する可能性があります。結核菌群の十分な割合を維持するためには、一方では急速に増殖する化膿性微生物および腐敗性微生物を抑制し、他方では物質中に存在する結核菌の生存能力を最大限に維持できる、穏やかな処理方法を採用する必要があります。
材料、その均質性、汚染レベルに応じて、播種前処理には様々な除染剤が使用されます。痰の場合は4%水酸化ナトリウム溶液、10%リン酸三ナトリウム溶液、塩化ベンザルコニウムリン酸三ナトリウム、最終NaOH濃度1%のNALC-NaOH（N-アセチル-L-システイン-水酸化ナトリウム）、尿などの液体材料の場合は3%硫酸溶液、汚染されたサンプルや脂肪含有材料の場合は最大5%のシュウ酸溶液です。さらに、場合によっては酵素や界面活性剤（洗剤）が使用されます。Tweenなどの洗剤を使用すると、結核菌細胞の死滅率が低くなります（40～50%が生存）。ただし、これらは液体材料にのみ使用できます。キットで製造されるNALC-NaOHは、世界で最も広く使用されています。この方法では、結核菌細胞集団の85%以上を分離できます。組織を含む固形材料の除染は、均質化処理中に材料の分散度合いを予測することが難しいため、より困難です。例えば、リンパ節生検の処理では、外来細菌叢による汚染頻度が増加することがよくあります。この場合、1%エトニウムを使用できます。
不均質な物質は、除染剤の存在下でガラスビーズを用いて均質化されます。液体物質は事前に遠心分離され、沈殿物のみが処理されます。
播種と孵化の技術
予備処理後、材料は遠心分離され、結核菌が沈殿して沈殿物中の結核菌含有量が増加します（「沈殿物増菌」）。得られた沈殿物は中和され、濃厚な栄養培地または液体（半液体）培地を入れた試験管の表面に接種されます。残った沈殿物から顕微鏡検査用の塗抹標本を作製します。接種方法は、診断材料の交差汚染を防ぐ必要があります。
微生物学的研究の結果を臨床的に確実に解釈するには、次の規則を遵守する必要があります。同じ診断材料のサンプルから顕微鏡的研究と培養研究を並行して実行する必要があります。
接種した試験管は、水平に立てた状態で37 ℃の恒温槽内に2日間置きます。これにより、培養液への物質の吸収がより均一になります。2日後、試験管を垂直に立て、ゴムまたはシリコン製のストッパーで密封し、播種した培地の乾燥を防ぎます。
作物は37 ℃のサーモスタットで10～12週間保管され、毎週定期的に検査されます。検査のたびに以下のパラメータが記録されます。
- 播種日から目視で成長が観察できる期間。
- 増殖率（CFU数）
- 培養物への外来微生物叢または真菌の汚染（そのような試験管は除去されます）
- 目に見える成長は見られません。チューブは次回の検査までサーモスタット内に残しておきます。
栄養培地
結核菌の培養には、固形、半流動性、液体など、様々な栄養培地が用いられます。しかし、既知の栄養培地には、すべての結核菌細胞の増殖を保証する特性を持つものはありません。そのため、培養効率を高めるには、組成の異なる2～3種類の栄養培地を同時に使用することが推奨されます。
結核病原体の一次分離および薬剤感受性試験のための標準培地として、WHOはローエンシュタイン・イェンセン培地を推奨しています。これは卵型濃厚培地で、細菌学的検査で陽性の材料を播種してから20～25日目に結核菌の発育が見られます。細菌学的検査で陰性の材料を播種する場合は、より長い培養期間（最大10～12週間）が必要です。
我が国では、ER Finnが提唱するFinn-II卵培地が広く普及しています。この培地は、L-アスパラギンの代わりにグルタミン酸ナトリウムを使用している点で異なり、これにより結核菌におけるアミノ酸合成のための別の経路が活性化されます。この培地では、Lowenstein-Jensen培地よりもやや早く増殖が始まり、結核菌の分離頻度は6～8%高くなります。
肺外結核の細菌学的診断の効率を高めるため、栄養培地複合体に改良Finn-II培地を加えることが推奨されます。増殖を促進するため、Finn-II培地に0.05%のチオグリコール酸ナトリウムを追加添加し、酸素濃度を低下させます。結核菌の酵素系を脂質過酸化反応による毒性産物から保護するため、抗酸化剤であるα-トコフェロール酢酸塩を0.001μg/mlの濃度でFinn-II培地に添加します。診断材料は標準法に従って播種します。
ロシアの結核対策研究室では、GGモルドフスキーが提案した栄養培地「ノヴァヤ」、VAアニキンが開発した栄養培地A-6およびA-9など、他の改良された濃厚栄養培地も使用されています。
化学療法中に微生物細胞のさまざまな代謝系に損傷が発生するため、結核菌群の一部は従来の栄養培地で正常に発育する能力を失い、浸透圧バランスのとれた（半液体または液体）栄養培地が必要になります。
診断材料培養の結果の評価と記録
一部の菌株や種類の結核菌は成長が遅く、90日目でも増殖が見られることがあります。このような菌の数は少ないですが、播種後2.5～3ヶ月間は恒温槽で管理する必要があります。
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の毒性培養物は通常、固形卵培地上で様々な大きさと外観のR型コロニーとして増殖します。コロニーは乾燥し、しわがあり、象牙色で、わずかに色素を有しています。他の培地では、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のコロニーはより湿潤性を示す場合があります。化学療法の終了後または治療中には、湿潤増殖を伴う滑らかなコロニー（S型コロニー）が分離されることがあります。
培養物を分離する際には、結核性抗酸菌を非結核性抗酸菌および抗酸菌と区別するために、一連の特別な研究が行われます。
増殖したコロニーから採取した塗抹標本をZiehl-Neelsen染色法で染色し、必須の顕微鏡検査を実施することで陽性反応が出ます。結核菌の増殖の場合、塗抹標本中に鮮やかな赤色の桿菌が単独で、または集団で存在し、フェルト状または編み紐状のクラスターを形成しています。若い培養物、特に長期化学療法を受けた患者から分離された培養物では、結核菌は顕著な多型性によって区別され、桿菌に加えて、真菌の菌糸に似た短く球状または細長い変異体も存在します。
結核菌の増殖強度は、以下の基準に従って示されます。(+) - 試験管内1～20 CFU（細菌排泄量が少ない）、(++) - 試験管内20～100 CFU（細菌排泄量が中程度）、(+++) - 試験管内100 CFU超（細菌排泄量が多い）。結核の臨床診断では、特定の方法で結核菌が検出されたかどうかを示すだけでは不十分です。結核菌集団の量と性質、その構成と特性を詳細に把握することも必要です。これらのデータにより、病態を正しく解釈し、適切な治療計画を立て、迅速に治療を調整することができます。
近年、結核菌の増殖を促進するため、様々な増殖添加剤を添加した寒天培地と特殊な混合ガスの使用が提案されています。これらの培地で結核菌を増殖させるには、培養中に二酸化炭素濃度（4～7%）を高めた雰囲気を作り出す必要があります。この目的のために、特殊なCO2インキュベーターが使用されます。しかし、最も大きな発展を遂げたのは、MGIT-BACTEC-960とMB/Bactといった自動化された結核菌培養システムです。
そのようなシステムの一つがMGIT（マイコバクテリア増殖指示管）システムです。これはハイテク開発であり、結核の細菌学的診断を迅速化し、第一選択薬および一部の第二選択薬に対するマイコバクテリアの感受性を判定するために設計されています。MGITは、VASTEC-960装置の一部として使用するように設計されています。微生物は、改良ミドルブルック7H9培地をベースとした液体栄養培地を用いて、専用の試験管で培養されます。マイコバクテリアの増殖を促進し、外来微生物叢の増殖を抑制するために、MGIT成長サプリメントとPANTA抗菌薬の混合物が使用されます。
微生物の増殖は光学的に記録されます。これは、結核菌が増殖中に酸素を消費する際に発生する蛍光に基づいています。酸素依存性蛍光色素が特殊な試験管の底に充填され、シリコン層で覆われています。結核菌の増殖は試験管内の酸素量と酸素濃度の減少につながり、蛍光が増加します。試験管に紫外線を照射すると、蛍光が可視化され、VASTES-960装置に内蔵された光センサーによって自動的に記録されます。発光強度は増殖単位（GU）で記録されます。増殖データは自動的にコンピュータに入力され、保存されます。増殖曲線をコンピュータで分析することで、非結核菌を含む様々な結核菌群の存在に関する情報が得られ、結核菌の増殖特性の評価にも役立ちます。
このようなシステムの導入により、結核菌の増殖期間は大幅に短縮され、標準的な濃厚栄養培地では平均33日であったのに対し、VASTEC-960では平均11日、MB/Bactでは平均19日となりました。ただし、これらのシステムには高度な資格を持つ人員が必要であることに留意してください。液体培地への播種は、必ずLowenstein-Jensen培地への播種も同時に行います。Lowenstein-Jensen培地は、結核菌が他の培地で増殖しない場合のバックアップとして機能します。
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結核菌の薬剤感受性の判定
結核菌の抗結核薬に対する感受性スペクトルと感受性の程度を決定することは、臨床的にも、薬剤耐性結核の蔓延に関する疫学的評価においても非常に重要です。さらに、薬剤耐性のモニタリングは、結核対策のあらゆる構成要素の活動状況を示す不可欠な指標であり、結核対策プログラム全体の有効性を評価することを可能にします。
薬剤感受性試験の頻度とタイミング：
- 治療開始前に、治療戦略と戦術を決定するために：
- 患者のさまざまな材料（痰、BAL、尿、滲出液、脳脊髄液など）から培養物を分離する場合、分離されたすべての株が検査されます。
- 臨床的および放射線学的変化がない場合の集中治療段階の終了時：
- 以下の場合に治療計画を変更する必要がある場合：
- 痰が陰性ではないこと
- 喀痰陰性後の再培養；
- 塗抹標本中のAFB量が当初減少した後、急激に増加する。結核患者の検体からは、薬剤感受性の異なる結核菌株が分離されることはよく知られている。株の抗結核薬に対する感受性は、薬剤のスペクトル、耐性発現の程度、頻度、速度によって異なる可能性がある。
結核菌の薬剤耐性の程度は、耐性の臨床的意義に重点を置いた確立された基準に従って決定され、薬剤の抗結核活性、薬物動態、病変における濃度、最大治療量などによって異なります。
結核菌の薬剤感受性の判定は現在、微生物学的手法を用いて行われています。
- 絶対濃度（固体または液体の栄養培地での希釈法）
- 比率、
- 抵抗係数。
通常、耐性は結核菌コロニーの目視による増殖という形で現れますが、結核菌の細胞分裂の初期段階で発色反応という形で増殖を誘導する方法があります。これらの方法により、試験時間は3～4週間から2週間に短縮されます。
WHO化学療法委員会が推奨する絶対濃度法は、統一された方法としてロシアで広く普及しています。方法論的には最も簡便ですが、実験手順の高度な標準化と精度が求められます。薬剤感受性試験は、抗結核薬を添加した栄養培地が入った試験管セットで構成されます。セットには、使用する薬剤の濃度が異なる2～3本の試験管、薬剤を含まない培地が入った対照試験管1本、そして非結核性抗酸菌の増殖を検出するための1000μg/mlサリチル酸ナトリウムまたは500μg/mlパラニトロ安息香酸が入った試験管1本が含まれます。
製剤を含む培地セットを調製するには、改良ローウェンシュタイン・イェンセン培地（デンプンを含まない）を使用し、フラスコに注ぎます。各フラスコに、対応する抗結核薬の希釈液を一定量加えます。フラスコの内容物をよく混合し、試験管に注ぎ、傾斜状態で85℃の温度で40分間凝固させます。培地は、自動温度制御機能付きの電気凝固装置で凝固させることが推奨されます。抗結核薬を含む培地
1列目は冷蔵庫で2～4℃で1か月間保存できますが、2列目の薬剤は2週間以内に保存してください。薬剤を含む培地を室温で保存することは推奨されません。抗結核薬の溶液を調製する際は、その活性を考慮し、薬剤の非特異的部分の分子量、純度などを考慮して濃度を計算します。薬剤感受性を決定するには、化学的に純粋な物質のみを使用します。
この方法の原理は、結核菌群の大部分の増殖を抑制する抗結核薬の濃度を測定することです。正しく実施すれば、この方法は高い信頼性を有します。
試験を行う前に、分離した結核菌培養物に異物微生物叢が含まれていないことを確認する必要があります。結核菌培養物を0.9％塩化ナトリウム溶液で調製し、1mlあたり5億個の微生物（光学濁度標準値5単位）を含む均一な懸濁液を調製します。得られた懸濁液を0.9％塩化ナトリウム溶液（1：10）で希釈し、懸濁液0.2mlを栄養培地セットの各試験管に加えます。接種した試験管を37℃の恒温槽に入れ、2～3日間水平に保ち、栄養培地の傾斜面に結核菌懸濁液が均一に接種されるようにします。その後、試験管を垂直位置に移動し、3～4週間培養します。結果は3～4週間後に記録します。
栄養培地上で臨床材料から病原体を分離するには少なくとも1～1.5ヶ月かかるため、この方法を用いた薬剤感受性試験の結果は、材料を播種してから2～2.5ヶ月後にしか得られません。これがこの方法の主な欠点の一つです。
結核菌の薬剤感受性試験の結果は、一定の基準に基づいて解釈されます。固形培地では、薬剤を添加した試験管で増殖した結核菌のコロニー数が20を超えず、薬剤を添加していない対照試験管では十分に増殖している場合、培養物は培地に含まれる薬剤の濃度に対して感受性があると判断されます。20を超えるコロニーが存在する場合にのみ、培養物は所定の濃度に対して耐性があると判断されます。実際には、試験管での増殖結果が20 CFUに近い場合、臨床指標の不明確な動態を説明できるため、感受性または耐性が境界線であることを臨床部門に通知する必要があります。
様々な製剤において、結核菌群の臨界割合の増殖が観察される特定の濃度が確立されています。これらの濃度は「臨界濃度」と呼ばれます。臨界濃度の製剤を添加した栄養培地における結核菌群の増殖量は、安定性の基準として用いられます。
国内の結核学診療において、薬剤耐性の判定は臨界濃度の判定のみに限定されません。これは、病原体の薬剤耐性レベルを拡張して定義することで、臨床医が薬剤併用による増強効果に関する知識を活用し、より正確な化学療法戦略を策定し、交差耐性を予測したり、既存の抗結核薬群の中でより効果的な薬剤を使用したりすることが可能となるためです。
絶対濃度法は最も簡便ですが、実施上の誤りに対して最も敏感です。特に第二選択薬に対する感受性を決定する際に信頼性が高く、ロシア国外で広く普及しているのは割合法です。割合法は絶対濃度法の欠点を考慮していますが、実施にはより労力がかかります。
この方法は絶対濃度法と非常によく似ています。薬剤を入れた試験管の準備は絶対濃度法と同じです。ただし、結核菌懸濁液のシード用量が10分の1に削減されるため、エタンブトール、プロチオナミド、カプレオマイシンなどの薬剤に対する一部の結核菌株の自然耐性の頻度が排除されます。対照として、試験管と同じシード用量の試験管を2本または3本使用し、連続して10倍および100倍に希釈します。耐性の基準は、結核菌の目視で観察される増殖の割合です。第1選択薬の場合、耐性の基準は、選択した臨界濃度に応じて、初期集団の1％の過剰増殖、第2選択薬の場合、初期集団の1％または10％を超える増殖です。
1997 年、WHO と国際結核連合の抗結核薬耐性検出作業部会はこれらの基準を調整し、Lowenstein-Jensen 卵培地で増殖する結核菌を以下の濃度で耐性とみなすことを提案しました。
- ジヒドロストレプトマイシン - 4μg/ml;
- イソニアジド - 0.2 µg/ml:
- リファンピシン - 40 mcg/ml:
- エタンブトール - 2 mcg/ml。
2001 年に、次の第 2 選択薬に対して臨界濃度 (臨界割合 1%) が提案されました。
- カプレオマイシン - 40 mcg/ml;
- プロチオナミド - 40 mcg/ml;
- カナマイシン - 30 μg/ml;
- バイオマイシン - 30 μg/ml;
- サイクロセリン - 40 mcg/ml;
- アミノサリチル酸 - 0.5 mcg/ml;
- オフロキサシン - 2 mcg/ml。
成長結果は、予備として 4 週間後に評価され、最終として 6 週間の栽培後に評価されます。
現代の結核化学療法で広く使用されているピラジナミドに対する薬剤感受性の判定には、200μg/mlが推奨される臨界濃度です。しかし、この薬剤の抗菌活性は酸性環境（pH <6）でのみ発現し、その維持が技術的に困難であるため、固形栄養培地におけるこの薬剤に対する薬剤耐性の判定に一般的に受け入れられている方法は未だ存在しません。さらに、多くの結核菌の臨床培養は、酸性環境の卵培地では生育しにくいことが知られています。
結核菌の薬剤感受性検査結果の品質を評価するために、Lowenstein-Jensen培地の各ロットを、標準博物館株H37Rvの感受性検査と並行して実施することで管理することが推奨されます。さらに、これらの方法によって再現性が高く、正しく解釈できる結果が得られるためには、一定の微生物学的基準を満たす必要があります。これには、結核菌培養物の生存率、均質な懸濁液および懸濁液を得るための基準、結核菌培養物の選択基準、そして選択した細菌塊の代表性が含まれます。細菌の排泄が極端に悪い場合、薬剤耐性検査の信頼性は低下します。
最近、自動化システムを用いた薬剤感受性判定法が有望視されています。この分野で最も進んでいるのは、VASTEC MGIT-960をベースにした開発です。この方法では、修正比例法に基づいて結核菌の薬剤感受性を判定します。判定中は、コントロールチューブと薬剤入りチューブの結核菌の増殖率を比較します。ストレプトマイシン、イソニアジド、リファンピシン、エタンブトールへの感受性を判定するには、SIREキットに含まれる増菌剤と抗生物質を使用します。ピラジナミドへの感受性を判定するには、PZAキットを使用します。試験中は、薬剤入り試験管に結核菌懸濁液を接種し、コントロールチューブにはピラジナミドを除くすべての薬剤の懸濁液の100倍希釈液を接種します。ピラジナミドの場合は、懸濁液の希釈度は10倍です。安定性の基準は、コントロールチューブの増殖が400 GUに達した時点で、マイコバクテリアの増殖指標が100 GUに達することです（「マイコバクテリア分離のための培養法」を参照）。結果は自動的に記録・解釈され、入力または選択されたプログラムによって設定されます。
試験管内の液体栄養培地中の最終濃度が臨界濃度として用いられる。現在、第一選択薬と一部の第二選択薬の両方について臨界濃度が設定されている。結核菌のサイクロセリンおよびアミノサリチル酸に対する感受性試験は、卵栄養培地を用いてのみ実施されている点に注意する必要がある。
記載したシステムを用いた詳細なプロトコルにより、分離培養（高濃度栄養培地を使用）とMGIT試験管内での結核菌の一次培養の両方において、薬剤感受性試験を実施できます。後者の選択肢は培養試験の実施時間を大幅に短縮し、従来の方法では3ヶ月目までしか得られなかった結核菌培養の完全な結果（薬剤感受性に関する情報を含む）を、材料採取後3週間以内に得ることを可能にします。患者が集中治療期にある場合にタイムリーな結果が得られれば、試験の比較的高額な費用を補うことができます。
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結核菌の分類
使用される栄養培地は厳密に選択的ではないため、分離された結核菌の鑑別は必須です。結核菌の鑑別が必要なのは、結核菌属の代表的な菌によって引き起こされる病理学的過程のいくつかの特徴、すなわち結核と結核菌症の病理経過と結果の相違、一部の抗結核薬に対する自然薬剤耐性の存在などです。
結核性結核菌群と非結核性結核菌の一次識別は、濃厚栄養培地上での成長速度、色素形成、コロニー形態、耐酸性の有無、成長に最適な温度などの特性に基づいて行われることが知られています。
残念ながら、M. tuberculosis 複合体の抗酸菌とその他の抗酸菌を確実に区別できる単一の実験室方法は存在しません。しかし、上記の兆候と以下に示すいくつかの生化学検査の結果を組み合わせることで、M. tuberculosis 複合体の抗酸菌を最大 95% の確率で特定することができます。
M. tuberculosis 複合体の結核菌 (M. tuberculosis、M. bovis、M. bovisBCG、M. africanum、M. microti、M. canettii など) をゆっくり増殖する非結核性結核菌と区別するために、基本的な生化学検査を使用して、以下の兆候の存在を検出します。
- ニコチン酸産生能（ナイアシン試験）
- 硝酸還元酵素活性;
- 耐熱性カタラーゼ;
- サリチル酸ナトリウム（1 mg/ml）を含む培地上で増殖した。
追加試験として、500 μg/ml パラニトロ安息香酸または 5% 塩化ナトリウムを含む培地での増殖試験も使用できます。
多くの細菌学研究室では、研究室の能力と専門家の方法論的能力が限られているため、これらの微生物を複雑なレベルでしか特定できません。
実地検査では、ほとんどの場合、M. tuberculosisとM. bovisの鑑別は、ナイアシン、硝酸還元酵素、ピラジナミダーゼ、および2μg/mlチオフェン-2-カルボン酸ヒドラジドを含む培地での増殖試験で十分です。M. tuberculosis群に属する結核菌は、以下の特徴を有することを考慮してください。
- 成長が遅い（3週間以上）
- 生育温度は35～37 ℃以内
- 色素沈着の欠如（象牙色）
- 顕著な抗酸性着色。
- ナイアシン検査陽性;
- 硝酸還元酵素検査陽性
- 耐熱性カタラーゼ（68℃）が存在しない。
- Lowenstein-Jensen培地での増殖の欠如：
- 1000 µg/ml サリチル酸ナトリウム、
- 500 mcg/ml パラニトロ安息香酸、
- 5％塩化ナトリウム：
- 1-5 μg/ml チオフェン-2-カルボン酸の存在下で増殖します。
結核または抗酸菌症に関連するHIV/AIDS症例の登録頻度の増加に伴い、分離された抗酸菌の鑑別の重要性は著しく高まるでしょう。現時点では、地域の実務検査機関がこの量の検査を適切に実施できる体制が整っているかどうかは、絶対的な確実性がありません。
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結核の免疫学的診断
結核、あるいは結核菌に対する免疫反応モデルにおいて初めて発見された普遍的な現象、製剤、免疫学的検査が数多く存在します。これらには、BCGやツベルクリン、皮膚DST（ツベルクリン反応 - ピルケ・マントー反応）、感作動物へのツベルクリン皮下投与反応（コッホ現象）などが挙げられます。感染症における最初の抗体のいくつかも、結核で発見されました。もちろん、抗結核免疫のメカニズムとその遺伝子制御に関する理解が深まるほど、免疫に影響を与える免疫学的方法や製剤を結核学の実際的な問題の解決に幅広く活用できるようになります。
現在、最も重要かつ複雑な実際的課題は、住民を対象としたマススクリーニングにおける結核の検出であると考えられています。しかしながら、（限られた材料を用いた）「成功」に関する報告が数多くあるにもかかわらず、この目的に適した免疫学的手法（「誰にでも」再現可能な）や薬剤は存在しません。
免疫学的方法、特に血清学的研究（抗原、抗体の決定）およびツベルクリン誘発試験は、臨床診療で広く使用されています。
体内のさまざまな環境における抗原と抗体を特定する血清学的方法は、鑑別診断に使用される免疫学的研究の中で第一位を占めています。
結核菌に対する抗体の検出における特異性は、免疫分析に用いる抗原によって異なります。多くの抗原が提案されており、その最初のものはツベルクリンPPDです。
- 培養液からのPPDおよびその他の複合製剤。
- 超音波崩壊剤;
- トリトン抽出物およびその他の複合細胞壁製剤。
- 5抗原（ダニエル）
- 60抗原（コッチト）
- リポアラビノマンナン;
- コード因子（トレハロース-6,6-ジミコレート）
- フェノール性糖脂質およびその他の糖脂質;
- リポ多糖類;
- フィブロネクチン結合抗原;
- タンパク質（ほとんどの場合、組み換え）；81、65、38、34、30、19、18、16、15.12 KDA など。
ロシア国内外の科学者による長年の研究の結果、抗体形成の主なパターンと結核の血清学的診断の有効性が明らかになりました。抗原が複雑であるほど、検査の感度は高くなり、特異度は低くなります。特異度は、国民の結核菌および非結核性抗酸菌への感染状況、BCGワクチン接種の有無などによって、国によって異なります。小児における血清学的診断の有用性は、成人よりも低くなります。一次性結核（小児に多い）ではIgMの検出がより有用であり、二次性結核ではIgGの検出がより有用です。HIV感染者においては、抗体検出における血清学的診断の有用性は低下します。抗体検査の有効性は、プロセスの活性（結核菌の「分離」の有無、虫歯の存在、浸潤の程度）、プロセスの蔓延、その経過の期間など、いくつかの「臨床的瞬間」に依存します。
酵素免疫測定（EIA）法の感度は約70%です。本研究の有効性が不十分なのは、特異度が低いためです。以前は、特に結核感染後に肺に変化がみられる患者など、高リスク群における血清学的スクリーニングの可能性が検討されていました。
ELISAの特異性を高めるため、遺伝子工学によって得られるもの（ESAT-6など）を含め、より特異的な抗原が求められています（上記参照）。厳密に特異的な抗原（38 kDa、ESAT）を使用すると特異性は高まりますが、分析の感度は大幅に低下します。ELISA（Pathozyme ELISAキットなどの実験室検査システム）に加えて、側方濾過（Mycodot）を備えた免疫クロマトグラフィーキットや、検査結果を視覚的に評価するその他の同様の検査（膜ドット分析）も提供されています。これらの検査を実施する場合、分析には10～30分かかります。特別な機器は必要ありませんが、ある程度の主観を伴う結果の視覚的評価が必要です。これらの方法は、従来のELISAとほぼ同じ感度と特異性特性（それぞれ70％と90～93％）を備えています。
免疫分析法は、結核の鑑別診断、特に肺外結核の診断において用いられる様々な方法の中で、追加的な方法として一定の価値を有しています。ELISA法は、脳脊髄液検査による結核性髄膜炎の診断において最も効果的です。この場合、分析の感度は80～85%、特異度は97～98%です。結核性ぶどう膜炎の診断において、涙液中の結核菌抗体の検出の有効性に関する情報があります。
試験管内におけるγインターフェロン合成の誘導
ガンマインターフェロン（IFN-γ）は、マクロファージの酵素系を活性化することで特異的な免疫防御因子です。感作Tリンパ球によるIFN-γの産生誘導は、結核菌抗原との相互作用によって引き起こされます。
抗原としては、ツベルクリンPPDと遺伝子工学によって得られた特異抗原、特にESAT-6抗原（分子量6kDaの初期分泌抗原）とCFP-10（培養濾液タンパク質、10kDa）が使用されます。遺伝子組み換え抗原または組み換え抗原は、BCGワクチンおよびその他の結核菌の細胞には存在しません。ツベルクリンを使用する場合、IFN-γ誘導試験の結果はツベルクリン皮膚試験の結果と同等です（直接相関）。遺伝子組み換え抗原を使用する場合、試験結果はより特異的であり、以前のBCGワクチン接種に依存しません。結核感染者との接触のないワクチン接種を受けた個人を検査する場合、試験の特異度は99％です。結核患者における検査の感度は81～89％の範囲です。
血液から単離した全血球または単核球を結核菌抗原とともにin vitroで短期培養し、IFN-γ濃度を測定するか、IFN-γを合成するTリンパ球の数を計測する検査法と診断法が開発されています。試験管内で合成されたインターフェロン濃度は、IFN-γに結合するモノクローナル抗体を用いたELISA法で測定します。その後、標準IFN-γを用いて検量線を作成し、試験管内またはプレートウェル内のIFN-γ濃度を測定します。
Elispot テストでは、IFN-γ に対する抗体を塗布した皿の表面で IFN-γ を合成する T 細胞の数を数えます。
米国食品医薬品局（FDA）の承認を受けたin vitro IFN-γ誘導診断薬の開発者は、この検査では潜在性結核感染と活動性結核を鑑別できないと主張しています。したがって、感染率の高い地域では、この検査は直接的な診断価値がありません。しかしながら、我が国では、小児の結核感染とワクチン接種後アレルギーの鑑別、および治療中の特異的免疫レベルの評価に使用することができます。
現在、特定の結核抗原によるIFN-γ合成の誘導をin vitroで判定するための国内試験系の研究が行われている。
結核の免疫状態と経過、免疫補正
結核の治療中、人体内の抗原血症および免疫システムの状態に変化が起こります。
滲出液と組織の変化に関するデータは、概して矛盾している。唯一、十分な根拠をもって指摘できるのは、結核性肉芽腫には、原則として、相当数の活性化Tリンパ球が含まれているということである。
ヒトの結核治療における免疫学的メカニズムの役割を理解するために必要な、さらに 2 つの点について詳しく説明しておくことは理にかなっています。
- エイズ患者は多剤耐性を発症する率が特に高い。
- 多剤耐性の場合（HIV感染がない場合）、免疫障害（主にT細胞免疫）が特に重大です。
結核では、さまざまな免疫補正方法が広く使用されています。まず第一に、これらは主にT細胞免疫と単核食細胞系（胸腺ホルモン、イソホン、リコピッド、ポリオキシドニウムなど）に作用する薬剤、および全体の（弱毒化された）結核菌とその成分です。
結核の分子生物学的診断
感染症診断における分子生物学的手法は、主に細菌およびウイルス病原体のゲノム物質を操作する手法であり、特定の遺伝物質（病原体の特定の種または株に特異的なヌクレオチド配列を持つDNA断片）の同定、病原体の特定の薬剤に対する感受性を決定する遺伝子の特定のDNA配列の分析、および病原体の特定の遺伝子の機能活性の分析を目的としています。分子生物学的手法は、1985年にキャリー・マリス（1989年ノーベル賞受賞者）によるポリメラーゼ連鎖反応の発見以来、様々な細菌およびウイルス感染症の診断およびモニタリングにおける科学研究および実用化において広く普及しています。
ポリメラーゼ連鎖反応法の原理と機能
PCRは、試験管内で数時間でヌクレオチド配列（病原体DNAの断片）を数百万倍に増幅（増殖）することを可能にします。単一のDNA鎖の存在下で反応を行うことで、分析の非常に高い感度が実現されます。
DNA 鎖の特定の部分のヌクレオチド配列によって微生物の遺伝的独自性が決まり、これが PCR の高い特異性を説明します。
結核菌の特性の検出と研究におけるこの方法の重要性は、この微生物の生物学的特性によるもので、この微生物は非常にゆっくりと成長します。培養中の結核菌の DNA の倍加時間は 12 ～ 24 時間です。
PCR 法の原理は増幅です。つまり、試験管内の微小体積内で特定の DNA 配列のセクションを、それぞれ異なる温度条件で行われる以下の 3 つの反応段階を周期的に繰り返し、何百万倍にも増幅することです。
- ステージ I - 加熱により二本鎖 DNA が変性し、鎖が分岐する。
- ステージ II - 増幅のために選択された厳密に特定の DNA 断片の鎖の末端部分とプライマー（プライミングオリゴヌクレオチド）の相補的結合（ハイブリダイゼーション）。
- ステージ III – 熱安定性 DNA ポリメラーゼを使用して DNA 断片鎖を完成します。
増幅のためには、試験管にマトリックスDNA分子を入れておく必要があります。対応する窒素塩基（アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C））を含む4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ヌクレオチド）、18～20塩基対からなる人工合成プライミングオリゴヌクレオチド（プライマー）、最適温度が68～72 ℃である耐熱性酵素DNAポリメラーゼ、そしてマグネシウムイオンが必要です。
PCRの特異性はDNA断片の選択に依存します。それに応じて、フラッキングプライマーオリゴヌクレオチドが合成されます。ハイブリダイゼーションとDNA鎖の完成の特異性は、アデニン-チミン、グアニン-シトシンといった窒素塩基対の相補性の原理によって決定されます。
結核複合結核菌のゲノムを決定するために、ほとんどの検査システムで最も効果的な増幅標的はIS6110 DNA断片です。ほとんどの結核複合結核菌株はゲノム中にIS6110断片を多数（10～20）繰り返しており、これにより特異性とともに分析の高感度が保証されます。同時に、IS6110断片の繰り返し数が少ない、またはIS6110断片を欠く結核複合結核菌株も報告されています。
生物学的サンプルからのDNA分子の抽出
PCR を実行するには、病原体の DNA 分子を、最小限の量の非特異的 DNA と、酵素 (DNA ポリメラーゼ) のさまざまな阻害剤とともに、最小限の容量で生物学的材料から分離する必要があります。
サンプル調製は、研究対象サンプルと単離されたDNA分子との交差汚染を防ぐ条件下で行う必要があります。そのためには、実験室を紫外線で、床面、実験台および装置の作業面を塩素含有溶液で前処理する必要があります。また、清潔な手袋、使い捨て試験管、自動ピペット用のチップを使用する必要があります。
大量の白血球、細胞残渣、塩分を含まない臨床サンプル（脳脊髄液、気管支洗浄液）から結核菌の DNA を分離するには、サンプルを毎分 3000 ～ 4000 回転で遠心分離し、沈殿物に 2% トリトン X-100 溶液 20 ～ 30 µl を加え、90 o C で 30 分間加熱するだけで十分です。
喀痰サンプルの調製には、効率的な液化が必要です。通常、4%水酸化ナトリウムとN-アセチル-L-システイン（NALC）を、サンプル粘度に応じて1サンプルあたり50～80mg使用します。NALC溶液は事前に調製するか、NALC粉末を乾燥状態でサンプルに直接添加します。液化後、サンプルは50 mlスクリューキャップチューブに入れ、3,500～4,000 rpm（3,000 g）で15分間遠心分離します。これは、喀痰培養前の調製に推奨される条件と同じです。
堆積物からDNAを抽出するには、溶解剤として5～6モル濃度のグアニジンイソチオシアネート溶液を用い、DNA分子を吸着する微細孔を持つ酸化ケイ素粒子（「珪藻土」）を用いる方法が最もよく用いられます。次に、阻害物質を含む非特異的物質を2.5モル濃度のグアニジンイソチオシアネート溶液とエタノール溶液で洗浄し、DNA分子を水中で脱着させます。これらのサンプルを用いてPCRを行います。DNA抽出技術を簡素化するため、「珪藻土」の代わりに酸化ケイ素でコーティングされた磁性微粒子が用いられることがよくあります。この場合、遠心分離の代わりに、マイクロチューブ用の特殊な磁気スタンドを用いて粒子を沈殿させます。
ロシアでは、結核菌を免疫磁気分離し、病原体DNAを抽出する独自の方法が開発されました。結核菌の免疫磁気分離には、酸化ケイ素でコーティングされた3～5μmの強磁性粒子を使用し、これに結核菌に対するポリクローナル（ウサギ）抗体を化学結合で結合させます。喀痰サンプルはアルカリ溶解後、酸性トリス塩酸溶液で中和し、免疫磁気吸着剤とともにインキュベートします。その後、交換可能なチップを備えた磁気ロッドを使用して免疫強磁性粒子を収集し、マイクロチューブに移して沈殿させます。2%トリトンX-100溶液20～30μlを加え、90℃で30分間加熱します。上清をPCR分析用のDNAマトリックスとして使用します。
生検標本からの結核菌DNAの抽出は困難な問題です。生検標本の溶解には、酵素プロテアーゼKを最終濃度200～500 mg/lで使用し、56 ℃で一晩反応させます。その後、既知の方法のいずれかを用いて抽出します。生検標本のPCR分析では、過剰な非特異的DNAが反応阻害を引き起こすことが多く、DNA抽出を繰り返す必要があります。
結果検出方法
反応が完了したら、病原体 DNA の増幅された断片をさまざまな方法を使用して識別します。
ゲル電気泳動法はよく知られています。この場合、得られたDNA断片は、目的のDNA断片を含む陽性対照、または標準的な分子マーカーを用いて決定された断片の既知のサイズ（ヌクレオチド対数）によって識別されます。
二本鎖 DNA に含まれる特定の染料である臭化エチジウムの存在下では、合成された DNA 断片が紫外線の影響を受けて光るバンドとして現れます。
開始からの移動距離に基づいて電気泳動によって決定される DNA 断片のサイズは、既知の分子量マーカーまたは陽性対照と一致する必要があります。
PCR 結果を決定する他の方法は、一本鎖 PCR 産物と相補オリゴヌクレオチド (ビオチンで標識された DNA プローブ) とのハイブリダイゼーションを基本とし、その後、例えばストレプトアビジン - アルカリホスファターゼ複合体をビオチンに結合させることにより、酵素反応を使用して検出します。
このタイプの検出に基づいて、酵素反応が発生した後にサンプルの光学密度を読み取ることで PCR 結果の検出が自動的に実行される PCR アナライザーが開発されました。
これらの方法の欠点としては、比較的短いDNA分子の断片による実験室内汚染の可能性が挙げられます。これらの分子が新たに検査するサンプルに混入すると、PCRのマトリックスとなり、偽陽性の結果につながります。
この点に関して、偽陽性結果を防ぐため、厳格な隔離規則が導入されています。生物学的サンプルからのDNA抽出を行う部屋と、クリーンゾーンからの結果（電気泳動）の検出を行う部屋です。これらの部屋は、汚染の可能性のあるゾーンです。もう一つの隔離ゾーンは、検査対象のDNAサンプルをPCR反応液とともに試験管に注入するためのクリーンルームです。そして最後に、主要装置であるDNA増幅装置は、別の部屋（できればオフィスなど）に移動することが想定されています。
以前の反応生成物（アンプリコン）による汚染を防ぐため、一部のPCR検査システムでは、デオキシヌクレオシドチミジンの代わりにデオキシヌクレオシドウリジンが使用されています。これは、in vitro鎖合成中に適切な位置に合成されるもので、天然DNAに含まれる窒素塩基チミンがウラシルに置換されます。分析対象物質の反応混合物にウラシルDNAグリコシラーゼを添加すると、デオキシウリジンを含む汚染断片のみが分解され、デオキシチミジンを含む天然DNAは分解されません。その後、94℃で加熱処理することでこの酵素は不活性化され、PCR増幅に影響を与えません。
RRNAの等温増幅に基づく検査システムがあり、このシステムではまず逆転写とDNA分子の合成が行われ、これがその後のRNA分子合成の基質となります。RNAアンプリコンは、反応チューブ溶液中でのハイブリダイゼーション中に、アクリジン染色されたDNAプローブを用いて検出されます。この方法は、高感度であることに加え、分析を1本のチューブ内で実施できるため、コンタミネーションを防止できるという利点があります。著者らによると、この方法の呼吸器系サンプルにおける感度は90%に達し、特異度は99～100%です。
リアルタイムPCRには、新しい検出法が採用されています。これらの方法の主な違いは、PCRとその結果の検出が1本の密閉試験管内で同時に行われることです。これにより、分析方法が技術的に簡素化されるだけでなく、以前のPCR産物による実験室施設やサンプルの汚染を防ぐことができます。
リアルタイムPCRでは、PCR中に増幅された特定のDNA断片と蛍光DNAプローブとのハイブリダイゼーションから生じる蛍光によって結果が検出されます。蛍光DNAプローブの構造は、PCR中に増幅された目的のDNA分子と特異的にハイブリダイズした場合にのみ、酵素反応の結果として蛍光マーカーが放出されるか、蛍光クエンチャー分子から遠ざかるように構築されています。プローブとハイブリダイズする分子の数が増加するにつれて、検出可能なレベルまでの蛍光の増加は増幅産物の分子数に比例します。DNA断片分子の数はPCRサイクルごとに倍増するため、蛍光が検出され増加するサイクル数は、元のサンプル中のDNA分子数に反比例します。結核菌DNAの対応する断片分子の既知の濃度をいくつかキャリブレーターとして反応に導入すれば、研究対象物質中のDNAゲノム数をコンピュータプログラムを用いて計算することができます。
各標準サンプルは複製されます。定量的基準は、検出可能な蛍光の開始と増加に必要な PCR サイクルの最小数です。横軸はサイクル数、縦軸は蛍光値です。DNA 濃度は、蛍光が現れるのに必要なサイクル数に反比例します。右の列のウィンドウ (21 ～ 32) には、対応する濃度のサイクル数が表示されます。DNA 断片の 10 倍濃度 10 2～ 10 6 ml 間の差は、3.2 ～ 3.4 サイクルです。2 人の患者の場合、IS6110 断片の濃度は約 10 3 /ml と 10 4 /ml でした。Mycobacterium tuberculosis のゲノム内で分析された断片の繰り返し数 (6 ～ 20) を考慮すると、臨床サンプル中の Mycobacterium tuberculosis の数は、それぞれ約 100 個と 1000 個です。
結核診断におけるPCRの応用
PCR法は、結核の迅速診断において最も広く利用されています。臨床検体（喀痰、気管支洗浄液、胸膜滲出液、尿、脳脊髄液、骨溶解穿刺、女性生殖管穿刺液、各種生検）における結核菌の検出がこれにあたります。オランダで行われた研究では、肺結核と確定診断された患者340名から約500検体の喀痰と気管支洗浄液を用いて、PCR法、培養法、塗抹標本顕微鏡検査法の感度比較が行われました。分析感度はそれぞれ92.6%、88.9%、52.4%でした。特異度はいずれも約99%でした。
塗抹顕微鏡検査、Lowenstein-Jensen培地への播種、VASTES試験システム、PCR法を用いて、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の検出効率を比較しました。PCRの感度は74.4%、顕微鏡検査は33.8%、固形培地への播種は48.9%、VASTESは55.8%でした。Lowenstein-Jensen培地への播種では平均24日、VASTESは13日、PCRは1日でした。
結核治療の有効性を監視するための高感度かつ迅速な方法として PCR を使用する可能性についても説明します。
PCR 法による結核菌 DNA の検出は、有効な化学療法と併用すると、蛍光顕微鏡による細菌排泄の検出に比べて平均 1.7 か月、細菌学的検査に比べて 2.5 か月という長い期間をかけて行われます。
肺外結核の診断
PCR が感度の高い方法として特に重要なのは、肺外型の場合にです。なぜなら、まさにこれらの型では、診断材料中の結核菌を判定するための臨床的および放射線学的方法や従来の細菌学的方法が効果がないからです。
尿サンプルを検査したところ、PCR検査の結果、活動性尿路結核患者17名中16名で陽性、非活動性腎結核患者4名と非結核性尿路疾患患者39名で陰性であった。
原因不明の発熱があり、結核性の疑いのある患者の骨髄穿刺液を用いたPCR分析の有効性が実証されました。小児の結核性リンパ節炎の診断のため、結核性リンパ節炎が疑われる67人の小児の102の穿刺吸引液と生検サンプルが検査されました。陽性の結果が得られ、リアルタイムPCRでは71.6%、蛍光顕微鏡検査では46.3%、培養検査では41.8%でした。ネコひっかき病患者の50のリンパ節生検では、すべて陰性でした。このように、PCR分析の100%の特異性が実証されました。同じ研究で、リンパ節の穿刺生検でM. aviumが検出できることも示されました。
不妊症における女性性器結核の診断は、最も難しい診断上の問題の一つとして知られている。腹腔鏡検査で結核が疑われた25人の患者のうち14人（56%）で、子宮内膜生検、子宮内膜吸引液、ダグラス窩液のサンプルを用いたPCR検査で陽性の結果が得られた。塗抹標本検査および培養検査では、それぞれ1件および2件の陽性結果が得られた。これらの症例はPCRも陽性であった。PCR陽性の結果が出た症例のほとんどは、組織学的検査で結核の特徴的所見が認められた症例であり、腹腔鏡検査で結核が疑われた症例は少数であった。腹腔鏡検査で結核のデータが得られなかった症例では、1件のみPCR陽性の結果が出た。
肺外結核の診断において、臨床医はPCR法を用いた血液検体の検査で病原体を特定できるかどうかについて疑問を抱くことがよくあります。文献データによると、進行したHIV感染においても、血液検体から結核菌（Mycobacterium tuberculosis）DNAの検出が可能です。結核菌（Mycobacterium tuberculosis）DNAは、腎移植を受け免疫抑制状態にある患者の様々な臓器に生じた全身性結核においてのみ検出されました。
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結核菌の種の同定
PCR法は、結核群のマイコバクテリアおよび一部の非結核性マイコバクテリアを一次培養後に迅速に同定するのに非常に効果的です。この場合、PCRを使用することで、陽性結果のその後の培養同定に必要な7〜10日を節約できます。PCR研究は、高感度を達成するために臨床材料の複雑なサンプル調製を必要としないため、技術的に非常に簡単です。このようなテストシステム（Organon社のMB BacT）で80の陽性培養物を検査した場合、すべての陽性PCR分析結果は厳密に特異的であり、1日以内に実行されました。培養で得られた他のタイプのマイコバクテリアを同定するには、病原体DNAをアクリジンで標識した特異的DNAプローブとハイブリダイズさせ、化学発光計を使用して化学発光の出現によって株を検出するか、ハイブリダイゼーション後にニトロセルロースストリップ上で目視評価を行います。このキットは、Mycobacterium tuberculosis 複合体、M. avium、M. avium 複合体、M. kansasii、および M. gordonae という限られた数の菌種を識別します。
A. Telentiらは、PCRとそれに続く2つの制限酵素（DNA分子を特定の位置で切断する酵素）処理に基づく、臨床的に重要な結核菌の種同定のための比較的簡便かつ安価な方法も開発しました。この方法では、熱ショックタンパク質（65 kDa）をコードするDNA断片を増幅し、PCRで得られた439ヌクレオチド対のDNA断片を、Bste IIとNäe IIIという2つの酵素で別々に処理します。次に、アガロースゲル電気泳動を用いて、得られた2つの産物を分析し、長さ100～1000ヌクレオチド対の標準DNA断片（分子DNAマーカー）セットを用いて、そのサイズ（ヌクレオチド対の数）を決定します。定義された各種（M. tuberculosis、M. avium、M. intracelluare、M. kansasii、M. fortuitum）において、各制限酵素ごとに2～3個の異なるサイズのDNA断片が見つかります。得られた異なるサイズの DNA 断片を組み合わせることで、これらの種を互いに区別することができます。
生物学的 DNA マイクロアレイの技術が開発されており、これにより 1 回の研究で 100 種を超える結核菌を特定できるようになります。
種の同定は、16S rRNA の可変領域の PCR 増幅と、それに続く対応する一次構造と比較した増幅産物の配列決定によって行うこともできます。これにより、40 種を超える結核菌の同定が可能になります。
PCRは、M. bovisとM. bovis BCGの区別を含め、結核菌群内の菌種の同定にも使用できます。これは、ゲノム領域RD1、RD9、およびRD10における特定の遺伝子の有無を分析することによって行われます。RD1はM. bovis BCGには存在しませんが、M. bovisを含む毒性菌種には存在します。
PCRを用いた結核菌の薬剤感受性の判定
結核菌の薬剤感受性または耐性を判定するための分子遺伝学的手法の目的は、既知の遺伝子の特定のヌクレオチド配列における変異を同定することにあります。主な手法は、増幅後のこれらの配列を直接読み取る（シーケンシングする）か、PCRで増幅されたビオチン標識DNA断片とDNAプローブとのハイブリダイゼーションに基づいています。どちらの手法も、DNAプローブを用いた際に、酵素複合体（ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ）を用いてニトロセルロース膜上でハイブリダイゼーションが欠如または不完全となるヌクレオチド配列の置換を同定します（LIPA-Rif-TB法）。
薬剤感受性または耐性に関わるPCR増幅遺伝子領域における既知の変異に相補的な微小領域に局所的に固定されたDNAプローブの蛍光を測定する方法は、マイクロバイオチップ法と呼ばれています。この研究を実施するための基本的なアルゴリズムは次のとおりです。臨床サンプルまたは結核菌培養物からDNAを単離した後、PCRを実施して、リファンピシンに対する薬剤感受性に関わるgroB遺伝子、またはイソニアジドに対する感受性に関わる結核菌タンパク質をコードするkatGおよびinhA遺伝子の対応する断片を増幅する必要があります。PCRの結果はアガロースゲル電気泳動を用いて評価し、目的の長さの対応するDNA断片が得られたことを確認します。次に、2回目のPCRを実施してDNAに蛍光標識を導入します。PCRの結果は再びゲル電気泳動によって確認されます。その後、ハイブリダイゼーション（一晩インキュベーション）を行い、得られた材料をバイオチップ上で洗浄します。バイオチップは、薬剤感受性型の結核性抗酸菌の変異が起こり得る部位のヌクレオチド配列と相補的な多数の短いDNA鎖（プローブ）を小さなガラス板上に固定したものです。また、薬剤耐性の原因となる変異配列とも相補的です。プレート上のDNAプローブの位置は厳密に定義され、ハイブリダイゼーション中に観察される蛍光レベルは、専用の読み取り装置を用いて結果を判定するために確立されます。この点で、分析結果は専用のコンピュータープログラムを用いて決定されます。
近年、リアルタイムPCR技術に基づいて結核菌の薬剤感受性を判定する代替方法が開発され、これらの研究を密閉試験管モードで実施できるようになりました。
図13-13は、リアルタイムPCRを用いてリファンピシンに対する薬剤耐性を判定するための結核菌臨床培養の分析結果を示しています。218は対照サンプル（リファンピシン感受性）、93はSer-Trp TCG-TGG変異の陽性対照、4482はSer-Leu TCG-TTG変異の陽性対照、162～322は実験サンプルです。4つのチャネルの増幅速度曲線の計算結果：チャネル1：393 - Ser-Trp TCG-TGG変異の陽性対照、チャネル2：4482 - Ser-Leu TCG-TTG変異の陽性対照、162、163、172、295 - 実験サンプル、チャネル4：実験に参加したすべてのサンプルの増幅速度曲線。増幅反応の陽性対照。結論：解析の結果、リファンピシン耐性を決定する以下の変異が明らかになりました：サンプル162、163、172、295において、Ser-Leu TCG-TTGが同定されました。イソニアジドに対する薬剤耐性の判定にも、最も頻度の高い変異を決定するkatG遺伝子とinhA遺伝子を用いて同様の原理が用いられました。
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結核菌の菌株同定
結核菌の株同定に最も研究されている方法は、制限断片長多型（RFLP）と呼ばれる技術で、酵素Pvu IIで結核菌DNAを断片化（制限）し、得られた断片をその反復要素IS6110のDNA上の特定の配列とハイブリダイズさせる手法に基づいています。種内変異は、IS6110反復の回数とDNA上の位置の違い、および制限酵素の攻撃点（制限部位）とIS6110要素間の距離の多様性によって実現されます。この技術は非常に複雑で手間がかかります。結核菌培養物から単離したDNAを制限酵素で処理した後、ゲル電気泳動を行い、異なる長さのDNA断片をニトロセルロース膜に転写し、IS6110要素の断片とハイブリダイズさせて、酵素反応を用いて結果を検出します。得られた特異的なバンドパターンは、特定の結核性抗酸菌株のDNAを特徴づけます。コンピュータ解析により、株の同一性または関係性が明らかになります。RFLP法は最も識別力が高く、解析対象株間における差異を最も多く明らかにしますが、一部の株に見られるIS6110反復配列の数が少数（5未満）の場合、効果がありません。図13～14は、株のRFLPタイピング結果を示しています。
代替法として、スポリゴタイピング法（DR領域の直接反復配列間の中間に位置するスペーサーDNA配列の多型性を解析する）が考えられます。株のスポリゴタイピングでは、DR領域を限定するプライマーを用いてPCRを行い、その後、様々な長さの断片が形成され、これが様々な中間DNA領域とハイブリダイズします。研究者によると、DR領域のスペーサー配列の解析は、より簡便で生産性が高く、株の一次スクリーニングや予備的な疫学分析、そして臨床材料の直接的な研究に適していると考えられています。
明らかに、より効果的で技術的に利用しやすい方法はVNTR（英語の略語）法、つまり結核菌のDNAにおける正確なタンデムリピートの可変数を決定する方法です。この方法はPCRのみを使用し、追加の操作は必要ありません。異なる株や異なる遺伝子座におけるタンデムリピートの数は異なるため、PCR産物の電気泳動図から異なるサイズの断片を決定し、分析します。研究者によると、VNTR法を用いることで、RFLP法よりも高い菌株識別率が得られます。
近年、薬剤耐性が強いW-北京ファミリーの結核菌株（北京株と呼ばれることもある）の蔓延に大きな注目が集まっています。
分子生物学研究の質に対する基本要件
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PCR検査を実施するための主な規制文書
ロシア連邦保健省命令：2000年2月7日第45号、2003年3月21日第109号、2000年2月21日第64号。ガイドライン：1.3.1888-04「病原性グループIII-IVの病原性生物因子に感染した試料のPCR検査における作業構成」、1.3.1794-03「病原性グループI-IIの微生物に感染した試料のPCR検査における作業構成」（2003年）、3.5.5.1034-01「PCR法を用いた作業における病原性グループI-IVの細菌に感染した試験試料の消毒」（2001年）。結核の検出、診断および治療における微生物学的研究の統一方法に関するガイドラインの付録11。
スタッフ
分子生物学研究は、臨床検査診断医、細菌学者、ウイルス学者、臨床診断検査生物学者、および確立された方法で専門化と高度なトレーニングを受けた中等医学教育を受けた専門家によって実施される場合があります。
実験室の敷地の配置
以下の実験設備が必要です。
- サンプル処理エリア - 方法論ガイドライン 13.1888-04 に従って、病原性グループ III-IV の感染性物質を扱うために適応した実験室。
- PCR 反応混合物を調製するエリアは、実験室内の汚染から保護された「クリーン」なエリアである実験室です。
- • PCR産物の分析に電気泳動法またはハイブリダイゼーション法を用いる場合、増幅されたDNA断片を増幅チューブから抽出し、その結果として環境に放出される実験室は、PCR実験室の要件（方法論ガイドライン1.3.1794-03、方法論ガイドライン1.3.1888-04）に従い、前項で規定された部屋から完全に隔離する必要があります。電気泳動エリアからサンプル処理エリアおよび「クリーン」エリアへの人員、機器、材料、物体の移動、ならびに換気システムまたは通風による空気の移動は排除する必要があります。このエリアは、PCR産物の蛍光検出には必要ありません。
- 結果の記録と処理のための部屋には、コンピューターと必要な事務機器が備え付けられています。この部屋には、チューブを開けることなくPCR産物を検出するための機器が設置されている場合もあります。例えば、蛍光PCR検出器とリアルタイムPCR用のサーマルサイクラーなどです。
痰の一次処理に関する衛生上および疫学的要件は、結核菌を扱う際の標準的な微生物学的要件と同様です。
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PCR診断のための完全な実験機器セット
実験キットには以下の部屋用の機器が含まれています。
- サンプル準備室には、保護クラスII「SP-1.2」の層流フード、エッペンドルフ試験管用の加熱蓋付きソリッドステートサーモスタット、13,000 rpmのマイクロ遠心分離機、遠心分離機（「ボルテックス」）、温度範囲-20 ° C～+10 ° Cの冷蔵庫、「Proline」シリーズの可変容量ピペット、トラップフラスコOM-1付きポンプ、ピペットラック、ワークステーションラック200x0.5 ml、ワークステーションラック50x1.5 ml、試験管保管用ラック80x1.5 ml。
- 反応混合物調製室：PCRボックス保護チャンバー（「Laminar-C. 110 cm」）; 遠心分離機「Vortex」; 「Proline」シリーズの可変容量ピペット; ピペットラック; ワークステーションラック200x0.2 ml; 試験管を保管するためのラック80x1.5 ml; 温度範囲-20 ° C〜+10 ° Cの冷蔵庫;
- 電気泳動室：水平電気泳動チャンバー、電源、トランスイルミネーター、
- DNA増幅装置または核酸分析装置（リアルタイムPCR）とコンピュータおよびソフトウェアは、空いている部屋に設置できます。リアルタイムPCR技術を使用する場合は、電気泳動室は必要ありません。
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外部品質管理
客観的に信頼できる結果が得られることを保証するために、研究室は研究の質を外部から評価するシステムに参加する必要があります。
品質管理システムの参加者は、細菌細胞の凍結乾燥懸濁液が入ったアンプル 12 本 (うち 2 本には大腸菌が含まれています)、濃度 10 2 /ml の結核性抗酸菌 (非病原性株) が入ったアンプル 3 本、濃度 10 4 /ml の類似株の細胞が入ったアンプル 3 本、濃度 10 5 /ml の非結核性抗酸菌 M. avium-intracellure および M. kansasii が入ったアンプル 2 本を受け取ります。
外部品質評価のために送られるテストは、この分野で豊富な経験を持つ 2 つの独立した研究所で事前にテストされます。