コリネバクテリウム

ジフテリアは、主に小児に発症する急性感染症で、ジフテリア毒素による重度の中毒と、病原体の局在部位における特徴的な線維性炎症として発症します。病名はギリシャ語の「ジフテラ（皮膚、膜）」に由来し、病原体の増殖部位に灰白色の濃い膜が形成されることから名付けられました。

ジフテリアの病原体であるジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）は、1883年にE. Klebsによって膜切片から初めて発見され、1884年にはF. Lefflerによって純粋培養されました。1888年には、E. RouxとA. Yersinによって、ジフテリアの病因と病態において重要な役割を果たす外毒素を産生する能力が発見されました。1892年にはE. Behringによって抗毒素血清が製造され、1894年からジフテリアの治療に使用されたことで、死亡率が大幅に低下しました。この疾患に対する画期的な対策は、1923年以降、G. Raionによるジフテリア毒素の精製法の開発によって始まりました。

ジフテリアの原因菌は、コリネバクテリウム属（放線菌綱）に属します。形態学的には、細胞が棍棒状で、先端が肥厚し（ギリシャ語で「coryne」は棍棒の意味）、特に古い培養物では枝分かれし、顆粒状の封入体を含むという特徴があります。

コリネバクテリウム属には多数の種が含まれており、3 つのグループに分けられます。

• コリネバクテリアは人間や動物の寄生虫であり、病原性があります。
• 植物に病原性のあるコリネバクテリア。
• 非病原性コリネバクテリア。多くのコリネバクテリア種は、皮膚、咽頭粘膜、鼻咽頭、眼、呼吸器、尿道、性器に常在しています。

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

コリネバクテリアの形態

ジフテリア菌は、直線またはわずかに湾曲した非運動性の桿菌で、長さ1.0～8.0μm、直径0.3～0.8μmです。胞子や莢膜を形成しません。片端または両端が膨らんでいることが多く、メタクロマティック顆粒（ポリメタリン酸エステル）を含むことが多く、メチレンブルーで染色すると青紫色に染まります。検出には特殊なナイザー染色法が提案されています。この場合、桿菌は麦わら色に染まり、ボルチン顆粒は暗褐色で、通常は両極に位置します。ジフテリア菌はアニリン染料でよく染まり、グラム陽性菌ですが、古い培養物では変色し、グラム陰性染色を示すことがよくあります。特に古い培養物や抗生物質の影響下では、顕著な多型性を示します。 DNA中のG+C含有量は約60モル%です。

コリネバクテリアの生化学的性質

ジフテリア菌は好気性菌または通性嫌気性菌であり、最適生育温度は35～37℃（生育限界は15～40℃）、最適pHは7.6～7.8です。栄養培地をそれほど必要としませんが、血清または血液を含む培地ではよりよく生育します。凝乳ルー培地またはレフラー培地はジフテリア菌を選択的に培養するもので、培養開始から8～12時間後には、ピンの頭大の凸状コロニーとして成長し、色は灰白色または黄みがかったクリーム色です。表面は滑らかまたはわずかに粒状で、コロニーの周縁部は中心部よりもやや透明です。コロニーは融合しないため、培養液はシャグリーンレザーのような外観になります。スープ上では、増殖は均一な濁りとして現れるか、またはスープは透明なままで表面に薄い膜が形成され、それが徐々に厚くなり、崩れて、薄片となって底に沈みます。

ジフテリア菌の特徴の一つは、他の細菌の増殖を抑制するほどの濃度の亜テルル酸カリウムを含む血液培地および血清培地で良好に増殖することです。これは、ジフテリア菌が亜テルル酸カリウムを金属テルルに還元し、これが微生物細胞に沈着することで、菌群に特徴的な暗灰色または黒色を与えるためです。このような培地の使用は、ジフテリア菌の播種率を高めます。

ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）は、グルコース、マルトース、ガラクトースをガスなしで酸を生成して発酵しますが、スクロースは（原則として）発酵せず、シスチナーゼ、ウレアーゼ、インドールを生成しません。これらの特性により、ジフテリア菌は、眼粘膜（Corynebacterium xerosus）や鼻咽頭（Corynebacterium pseiidodiphtheriticum）に最も多く見られるコリネ型細菌（ジフテロイド）や他のジフテロイド細菌とは異なります。

自然界では、ジフテリア菌にはグラビス、インターメジン、ミティスという3つの主要な変異体（バイオタイプ）が存在します。これらは形態学的、培養学的、生化学的、その他の特性が異なります。

ジフテリア菌のバイオタイプへの分類は、分離頻度の高い患者のジフテリアの病型を考慮して行われました。グラビス型は重症ジフテリア患者から最も多く分離され、集団感染を引き起こします。ミティス型はより軽症で散発的なジフテリアを引き起こし、インターメディウス型は両者の中間的な位置を占めます。以前はミティス型に分類されていたコリネバクテリウム・ベルファンティは、独立した4番目のバイオタイプとして分離されました。グラビス型およびミティス型との主な違いは、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力です。コリネバクテリウム・ベルファンティ株は顕著な接着性を有し、毒素産生性および非毒素産生性の両方の変異株が存在します。

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

コリネバクテリアの抗原構造

コリネバクテリウムは非常に異質でモザイク状です。ジフテリア病原体の3つのタイプすべてに数十の体細胞抗原が見つかっており、それらに基づいて血清型に分類されます。ロシアでは血清学的分類が採用されており、それによればジフテリア菌は11の血清型に分類されます。そのうち7つが主要な血清型（1～7）で、4つがまれにしか見られない追加の血清型（8～11）です。6つの血清型（1、2、3、4、5、7）はグラビス型に属し、5つの血清型（6、8、9、10、11）はミティス型に属します。この血清型分類法の欠点は、多くの株、特に非毒素産生株が自発的に凝集または多凝集性を示すことです。

[ 11 ]

ジフテリア菌のファージ型別

ジフテリア菌の分類には、様々なファージタイピング法が提案されています。MD・クリロワの法によれば、9種類のファージ（A、B、C、D、F、G、H、I、K）を用いることで、グラビス型コリネバクテリアのほとんどの毒素産生株および非毒素産生株をタイピングすることが可能です。特定のファージに対する感受性、培養特性、抗原特性、そしてコリシン（殺菌タンパク質）の合成能力を考慮し、MD・クリロワはグラビス型コリネバクテリアを3つの独立したグループ（I～III）に分類しました。各グループには、ジフテリア病原体の毒素産生株と非毒素産生株のサブグループが含まれています。

コリネバクテリウム耐性

ジフテリア菌は低温に対して高い耐性を示しますが、高温では急速に死滅します。60℃では15～20分以内、沸騰させると2～3分以内に死滅します。あらゆる消毒剤（リゾール、フェノール、クロラミンなど）を通常濃度で使用すると、5～10分で死滅します。しかし、ジフテリア菌は乾燥に強く、乾燥した粘液、唾液、塵埃粒子の中で長期間生存することができます。微細なエアロゾル中では、ジフテリア菌は24～48時間生存します。

コリネバクテリアの病原性因子

ジフテリア菌の病原性は、いくつかの要因の存在によって決まります。

接着、定着、侵入の要因

接着に関与する構造は未だ特定されていないが、それらがなければジフテリア菌は細胞に定着することができない。その役割は、病原体の細胞壁のいくつかの成分によって担われている。病原体の侵襲性は、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、およびプロテアーゼと関連している。

病原体の細胞壁に含まれる毒性のある糖脂質。トレハロースの6,6'-ジエステルであり、コリネミコール酸（C32H64O3）とコリネミコール酸（C32H62O3）を等モル比で含む（トレハロース-6,6'-ジコリネミコレート）。この糖脂質は、病原体の増殖部位の組織細胞に破壊的な作用を及ぼす。

病原体の病原性と疾患の病態生理を決定する外毒素。ジフテリア菌の非毒素産生性変異体はジフテリアを引き起こしません。

外毒素は、不活性前駆体（分子量61kDの単一ポリペプチド鎖）として合成されます。細菌プロテアーゼ自体によって活性化され、ポリペプチドはジスルフィド結合でつながれた2つのペプチド（A（分子量21kD）とB（分子量39kD））に切断されます。ペプチドBは受容体機能を果たします。受容体を認識して結合し、膜内チャネルを形成します。このチャネルを通じてペプチドAが細胞内に侵入し、毒素の生物学的活性を発揮します。ペプチドAはADPリボシルトランスフェラーゼ酵素であり、NADからタンパク質伸長因子EF-2のアミノ酸残基の1つ（ヒスチジン）へのアデノシン二リン酸リボースの転移を確実にします。この修飾の結果、EF-2は活性を失い、転座段階でのリボソームによるタンパク質合成の抑制につながります。毒素は、中程度の変換プロファージの遺伝子を染色体中に持つジフテリア菌によってのみ合成されます。毒素合成をコードするオペロンはモノシストロニックで、1,900ヌクレオチド対から構成され、toxPプロモーターと3つの領域（toxS、toxA、toxB）を持ちます。toxS領域はシグナルペプチドの25アミノ酸残基（毒素が膜を通過して細菌細胞の細胞周縁部へ放出されることを保証）、toxAはペプチドAの193アミノ酸残基、toxBはペプチドBの342アミノ酸残基をコードしています。細胞によるプロファージの喪失、またはtoxオペロンの変異は、細胞をわずかに毒素産生性にします。逆に、非毒素産生性のジフテリア菌は、変換ファージによって溶原化され、毒素産生細菌になります。これは明確に証明されています。ジフテリア菌の毒素産生は、毒素変換コリネファージによる溶原化に依存しています。コリネファージは部位特異的組換えのメカニズムを利用してコリネバクテリアの染色体に組み込まれます。ジフテリア菌株は染色体に2つの組換え部位（attB）を持つことができ、コリネファージはそれぞれの菌株に同じ頻度で組み込まれます。

コリネファージtoxオペロン断片を含む標識DNAプローブを用いて、複数の非毒素産生性ジフテリア菌株の遺伝子解析を行った結果、それらの染色体にはコリネファージtoxオペロンと相同性のあるDNA配列が含まれているものの、不活性ポリペプチドをコードするか、「サイレント」状態、すなわち不活性状態にあることが示された。この点で、非常に重要な疫学的疑問が生じる。すなわち、非毒素産生性ジフテリア菌は、in vitroと同様に、自然環境下（人体）において毒素産生性ジフテリア菌へと変化する可能性があるのか、という疑問である。ファージ変換を用いて非毒素産生性コリネバクテリア培養物を毒素産生性コリネバクテリア培養物へと変化させる可能性は、モルモット、ニワトリ胚、および白色マウスを用いた実験で実証されている。しかし、これが自然流行過程において起こるのかどうか（そしてもし起こるとすれば、どの程度の頻度で起こるのか）は、まだ解明されていない。

患者の体内のジフテリア毒素は特定のシステム（主に交感神経・副腎系、心臓、血管、末梢神経が影響を受ける）に選択的かつ特異的な影響を及ぼすため、細胞内のタンパク質生合成を阻害するだけでなく、代謝にもその他の障害を引き起こすことは明らかです。

ジフテリア菌の毒性を検出するには、以下の方法を使用できます。

• 動物を用いた生物学的試験。ジフテリア菌の培養液濾液をモルモットに皮内感染させると、注射部位に壊死が生じた。体重250gのモルモットに4～5日目に皮下注射すると、最小致死量（20～30 ng）の毒素を投与すると、致死量に達する。毒素作用の最も特徴的な症状は副腎の損傷であり、副腎は腫大し、急激に充血する。
• 鶏の胎児の感染。ジフテリア毒素により死に至る。
• 細胞培養の感染。ジフテリア毒素は明確な細胞変性効果を引き起こす。
• ペルオキシダーゼ標識抗毒素を使用した固相酵素免疫測定。
• ジフテリア菌の染色体内の tox オペロンを直接検出するための DNA プローブの使用。

しかし、ジフテリア菌の毒性を判定する最も簡単で一般的な方法は、血清学的方法、すなわちゲル沈殿法です。その概要は次のとおりです。1.5 x 8 cmの滅菌ろ紙を、1 mlあたり500 AEを含む抗ジフテリア血清で湿らせ、ペトリ皿の栄養培地の表面に塗布します。皿を恒温槽で15～20分間乾燥させます。試験培養物をろ紙の両面にプラークで播種します。1枚の皿に複数の菌株を播種し、そのうち明らかに毒性のある菌株を対照として用います。培養液を入れたプレートを37℃で培養し、24～48時間後に結果を判定します。ゲル内での抗毒素と毒素の逆拡散により、両者の相互作用部位に明瞭な沈降線が形成され、対照となる毒素産生株の沈降線と合流します。非特異的沈降バンド（抗毒素に加えて、血清中に他の抗菌抗体が少量存在する場合に形成される）は遅れて出現し、発現が弱く、対照株の沈降バンドと合流することはありません。

感染後の免疫

重篤で持続性があり、実質的に生涯にわたる再発は稀で、罹患経験者の5～7%に認められます。免疫は主に抗毒性の性質を持ち、抗菌抗体はそれほど重要ではありません。

シック試験は、以前はジフテリアに対する免疫のレベルを評価するために広く使用されていました。この目的で、モルモット毒素の1/40を0.2 mlの容量で子供の皮内に注射しました。抗毒素免疫がない場合、24〜48時間後に注射部位に直径1 cmを超える発赤と腫れが現れます。このような陽性シック反応は、抗毒素が完全に存在しないか、その含有量が血液1 ml未満であることを示します。陰性のシック反応は、血液中の抗毒素含有量が0.03 AE/mlを超える場合に観察されます。抗毒素含有量が0.03 AE/ml未満であるが0.001 AE/mlを超える場合、シック反応は陽性または陰性になる可能性があります。さらに、毒素自体には顕著なアレルギー特性があります。したがって、抗ジフテリア免疫のレベル（抗毒素の定量的含有量）を決定するには、ジフテリアトキソイドで感作した赤血球診断薬を併用した RPGA を使用するのが適切です。

ジフテリアの疫学

感染源は、病人、回復期の人、または細菌を保有する健康な人のみです。感染は、空気中の飛沫、空気中の塵、および病人や健康な保有者が使用するさまざまな物（食器、本、リネン、おもちゃなど）を介して発生します。食品（牛乳、クリームなど）が汚染されている場合は、消化管からの感染の可能性があります。病原体の最も大量の排出は、病気の急性型で発生します。しかし、潜伏期の非定型型の病気の人は、入院せずすぐに発見されないことが多いため、疫学的に最も重要です。ジフテリア患者は、病気の全期間および回復期の一部において感染性があります。回復期の人の細菌保有期間は平均2～7週間ですが、最大3か月続くこともあります。

健康保菌者は、ジフテリアの疫学において特別な役割を果たしています。散発的な罹患状況においては、健康保菌者はジフテリアの主な媒介者となり、自然界における病原体の保存に貢献しています。毒素産生株の平均保菌期間は、毒素非産生株（約2～3か月）よりもやや短く（約2か月）、感染期間も長くなります。

毒素産生性および非毒素産生性のジフテリア菌の健常な保菌状態が形成される理由は完全には解明されていません。なぜなら、たとえ高いレベルの抗毒素免疫があっても、必ずしも病原体から完全に解放されるとは限らないからです。おそらく、抗菌免疫のレベルは一定の意味を持つのでしょう。疫学的に最も重要なのは、毒素産生性ジフテリア菌株の保菌です。

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

ジフテリアの症状

ジフテリアはあらゆる年齢層の人に発症する可能性があります。病原体は様々な臓器の粘膜や損傷した皮膚を通して人体に侵入する可能性があります。感染部位によって、咽頭、鼻、喉頭、耳、眼、性器、皮膚のジフテリアが区別されます。また、咽頭と皮膚のジフテリアなど、混合型となる場合もあります。潜伏期間は2～10日です。臨床的に発現するジフテリアでは、病原体の局在部位に特徴的な粘膜線維性炎症が発生します。病原体によって産生される毒素は、まず上皮細胞に作用し、次に近くの血管に作用して血管の透過性を高めます。滲出液にはフィブリノーゲンが含まれており、これが凝固すると粘膜表面に灰白色の膜状の被膜が形成されます。この被膜は下層組織と強固に癒着し、剥がれると出血を引き起こします。血管が損傷すると、局所的な浮腫が生じる可能性があります。咽頭ジフテリアは特に危険で、喉頭と声帯の粘膜の浮腫によりジフテリア性クループを引き起こす可能性があり、ジフテリアに罹患した小児の50～60%が窒息死していました。ジフテリア毒素が血液中に侵入すると、全身に重度の中毒を引き起こします。主に心血管系、交感神経・副腎系、末梢神経に影響を及ぼします。このように、ジフテリアの症状は、感染部位に応じた局所症状と、毒素中毒によって引き起こされる全身症状（無気力、無気力、皮膚蒼白、低血圧、心筋炎、末梢神経麻痺、その他の障害として現れる）の組み合わせから構成されます。ワクチン接種を受けた小児におけるジフテリアは、観察された場合、通常は軽症で合併症なく進行します。血清療法と抗生物質の使用以前の死亡率は50～60%でしたが、現在では3～6%です。

ジフテリアの臨床診断

ジフテリアの微生物学的診断法は細菌学的検査のみであり、コリネバクテリアの分離培養物を用いて毒性試験を行うことが義務付けられています。ジフテリアの細菌学的検査は、以下の3つのケースで実施されます。

• 咽頭、鼻、鼻咽頭に急性炎症を起こしている小児および成人のジフテリアの診断。
• ジフテリア病原体の発生源と接触した人の疫学的兆候によると;
• 孤児院、保育園、寄宿学校、その他児童および成人向けの特別施設に新たに入所した人々を対象に、ジフテリア菌の保有者の可能性の有無を調べる。

研究材料は、咽頭および鼻からの粘液、扁桃腺またはその他の粘膜からのフィルムであり、これらは病原体の侵入口となる。播種は亜テルル酸塩血清または血液培地に行い、同時に凝固血清ルー（凝固馬血清）またはレフラー培地（牛血清3：砂糖ブイヨン1）に行う。これらの培地では、8～12時間後にコリネバクテリアの増殖が見られる。分離培養物は、形態学的、培養学的および生化学的特性の組み合わせによって同定し、可能であれば血清型およびファージ型別法を用いる。いずれの場合も、上記の方法のいずれかを用いた毒性試験が必須である。コリネバクテリアの形態学的特徴は、塗抹標本の染色法としてグラム染色、ナイサー染色、メチレンブルー染色（またはトルイジンブルー染色）の3種類を用いることで最もよく研究される。

ジフテリアの治療

ジフテリアの特異的な治療法としては、1mlあたり少なくとも2000IUを含む抗ジフテリア抗毒素血清の使用があります。血清は、病気の重症度に応じて10,000IUから400,000IUの用量で筋肉内投与されます。効果的な治療法としては、抗生物質（ペニシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシンなど）とスルホンアミドの使用があります。細菌自身の抗毒素産生を促進するために、アナトキシンが使用されることもあります。細菌の保菌を除去するには、特定のコリネバクテリア株が高感受性を示す抗生物質を使用する必要があります。

ジフテリアの特異的予防

ジフテリア対策の主な方法は、計画的な集団予防接種です。この目的のために、複数の病原体に対する免疫を同時に獲得することを目的とした複合ワクチンを含む、様々なワクチンが用いられます。ロシアで最も広く普及しているワクチンはDPTです。これは、水酸化アルミニウムに吸着させ、ホルマリンまたはチメロサールで殺菌した百日咳菌の懸濁液（1mlあたり200億個）で、1mlあたりジフテリアトキソイド30凝集単位と破傷風トキソイド結合10単位が含まれています。子供は生後3ヶ月から予防接種を受け、その後、1歳半から2歳までの期間ごとに再接種を行います。最初の接種は1歳半から2歳、次の接種は9歳と16歳、そしてその後は10歳ごとに行います。

1959年にソ連で始まった集団予防接種のおかげで、1966年までに同国におけるジフテリアの発生率は1958年と比較して45分の1に減少し、1969年の指標は人口10万人あたり0.7でした。その後、1980年代に予防接種の量が減少し、深刻な結果をもたらしました。1993年から1996年にかけて、ロシアはジフテリアの大流行に見舞われました。主に予防接種を受けていなかった成人と子供が罹患しました。1994年には約4万人の患者が登録されました。これに関連して、集団予防接種が再開されました。この期間中に、9200万人の成人を含む1億3200万人が予防接種を受けました。2000年から2001年にかけて、定められた期間内に予防接種を受けた子供のカバー率は96%、再接種を受けた子供のカバー率は94%でした。これにより、2001年のジフテリアの発生率は1996年と比較して15分の1に減少しました。しかし、発生率を単発症例にまで減らすためには、生後1年目に少なくとも97～98%の乳幼児にワクチン接種を行い、その後も集団での再接種を確実に行う必要があります。毒素産生性ジフテリア菌と非毒素産生性ジフテリア菌の広範な保有状況を考えると、今後数年間でジフテリアが完全に根絶される可能性は低く、この問題の解決にはある程度の時間を要するでしょう。