結核の検査室診断

結核は現代の状況や科学的成果で診断しやすい疾患です。研究室での結核診断は、他の診断法の中心であり、X線検査法に次ぐものです。

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臨床血液検査

結核患者では、一般的な血液分析の変化は病理学的なものではない。限定された不活性型の結核では、赤血球は通常量で色が薄い。大量の浸潤または乾酪性肺炎場合、乾酪性リンパ節炎、特定の腸病変、ならびに大肺または術後出血やノートerythropeniaの小赤血球症、oligohromaziyu、polihromaziyuのための普及しています。マクロサイトーシス、特にポキロチオトスは、通常、重度の貧血を伴う頻度が非常に少なくなります。0.6〜1.0％から1％が非代償性網状赤血球によって特徴付けられる - ステップ結核における網状赤血球の数はsubcompensatedと、0.1〜0.6％の範囲を補償します。

場合結核は、いくつかの場合には（白血球の15000まで）、中程度の白血球増加があるかもしれない限られており、簡単なプロセスに存在する形態の患者2-7％において、12.5％で生じ、少ない放射線、 - 破壊および進行肺結核によって。

最も頻繁なシフトは、白血球の式で生じる。前立腺細胞の前に白血球の式を中程度にシフトさせた相対および絶対好中球の両方に印を付ける。複雑でない結核の場合、骨髄球は非常にまれである。結核患者のヘモグラムにおける病理学的粒度を有する好中球の数の増加は、このプロセスの持続時間を常に示す：重度の結核患者では、ほぼすべての好中球が病理学的細分性を含む。結核の発生が止まると、核のシフトは比較的迅速に正常に近づく。好中球の病理学的な粒状性は、通常、血小板における他の変化よりも長く持続する。

末梢血中の好酸球の含量はまた、プロセスの段階および生物のアレルギー状態に依存して変化する。その数は、疾患の重度及び長期流行でaneozinofiliyaと、逆に、吸収浸潤と胸水、ならびに一次結核の初期形態として増加するまで減少します。

原発性結核のほとんどの形態はリンパ球減少を伴うが、これは特定の変化の瘢痕化後でさえ何年も観察されることがある。悪化の段階における二次結核は、プロセスの重症度に応じて、正常数のリンパ球またはリンパ球減少を伴うことがある。

これは、結核性プロセス（ESR）フロー結核プロセスを評価し、その活性型を特定の値を持つを評価するために、赤血球沈降速度、追加のテストを決定する特別な位置を占めています。ESRの増加が病理学的プロセス（感染性炎症、化膿性敗血症、hemoblastosis、ホジキンら）の存在を示し、その重症度を示すが、正常レベルは必ずしもないESR病理が存在しないことを示しています。赤血球沈降の加速はグロブリン、フィブリノーゲン、コレステロールの血中濃度の増加に貢献し、血液の粘度を下げます。赤血球沈降の減速は、血液濃縮を伴う状態、すなわちアルブミンおよび胆汁酸の含有量の増加に特徴的である。

結核患者のヘモグラムは治療中に変化する。血液学的変化はより速く消失し、治療的介入がより成功する。しかし、様々な抗菌薬の造血への影響を念頭に置くべきである。好酸球増加、場合によっては白血球増加、白血球減少、無顆粒球増加症およびリンパ球/網状反応を引き起こすことが多い。得られたデータの体系的な血液学的制御および正確な分析は、患者の臨床状態、プロセスのダイナミクスおよび使用される治療の有効性を評価するために不可欠である。

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尿の臨床分析

泌尿器系の結核では、尿検査が主要な検査診断方法です。白血球尿、赤血球尿、タンパク尿、低イソステア尿症、結核菌、非特異的な細菌尿を観察することができます。

Leucocyturia - 化学療法前に泌尿器系の結核の最も一般的な症状だけで、このような尿管の内腔の完全閉塞など例外的な場合、中には具体的にはありません。Nechyporenko検査（尿1ml中の白血球の数の決意）は、より客観的で度leukocyturiaのnefrotuberkulozeを評価するのに役立ち、そしていくつかの場合には正常尿検査でそれを識別します。しかし、急性および慢性腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、腎臓および尿管結石において白血球尿症が起こりうることを考慮する必要があります。

赤血球尿。白血球尿症が含まれる。尿生殖器系の結核の最も頻繁な検査室徴候の1つと考えられている。血尿の頻度は、プロセスの有病率に依存し、腎臓において有害な結核が進行するにつれて増加する。白血球尿症のない赤血球尿症は、腎結核の初期段階でより典型的である。leukocyturia上で有力な血尿、 - 非特異的腎盂腎炎との分化における腎結核の賛成で重要な引数。

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生化学的血液検査

結核では、いくつかの生化学的パラメータの変化は、主に、プロセスの段階、合併症および様々な付随する疾患に依存する。肺および他の器官の不活性結核患者では、血清の全タンパク質およびタンパク質画分は変化せず、その正常な含有量を決定する。

急性型の疾患では、慢性型の結核の悪化および進行とともに、アルブミン - グロブリン係数が減少する。

結核およびその合併症有機損傷や肝臓の機能状態を評価する上で必須では血清総及び直接ビリルビン、AST（ACT）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の決意です。アミノトランスフェラーゼのレベルの動的決定。結核患者の治療におけるビリルビンは、特に重度の形態では、結核患者の生化学的検査の必須成分であり、毎月実施される。

腎臓の機能状態の評価には、血清クレアチニンの測定およびCockcroft-Gaultの式による糸球体濾過率の計算が含まれる。Rebergの試料を用いた糸球体濾過率の計算は、あまり正確でない結果を与える。

結核患者の動的な生化学的研究の主な目標は、プロセスの経過、薬物の副作用のタイムリーな検出、および結果として生じる恒常性障害の適切な是正を監視することである。

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非肺結核における生化学的検査法の応用

最も有益な指標は、生体液中のツベルクローステアー酸の含有量ですが、その定義は技術的困難（ガスクロマトグラフィーと質量分析の必要性）に関連しています。

液体中で測定される酵素であるアデノシンデアミナーゼの活性の前向き測定：滑膜、心膜、腹水または脊髄。アデノシンデアミナーゼの主要な生産者は、リンパ球および単球である。生物学的液体中のアデノシンデアミナーゼの活性の測定は、結核滑膜炎、リンパ節の結核、結核髄膜炎、結核性腸炎の診断を容易にする。

それらの非特異性に起因するいくつかの生化学的インジケータは、病変の焦点に近い生物学的液体においてのみ決定される。ツベルクリンの皮下注射または皮内注射に応答して（通常、それの48および72時間後）、インジケーターのレベルを測定する。その後、マーカーレベルのインクリメントの度合い（％）を初期レベルに対して計算する。

様々な性質の腎臓が罹患している場合の外観は、トランスムニダーゼの臓器特異的酵素の活性の尿における最適な測定である。トランスアミダーゼの研究は、局所炎症過程を悪化させるためにツベルクリンの皮下注射の条件下でのみ正当化される。最初に50mgのツベルクリンを導入してから24~72時間後に尿中のトランスアミジンの活性を測定する。発酵槽を2倍以上に拡大することで、82％の症例で、慢性腎盂腎炎の悪性化と腎臓の活動性結核を区別することができます。

女性生殖器官の結核では、挑発的なツベルクリン試験の条件で、血液中のハプトグロビンおよびマロンジアルデヒドの濃度が決定される。皮下注射したツベルクリンを50μMの用量で72時間後に2回目の生化学的試験を行った。結核病因の場合、ハプトグロビンのレベルの増加の程度は28％以上であり、マロンジアルデヒドのレベルは39％以上である。ダグラス空間から得られた腹腔液中のアデノシンデアミナーゼの活性の測定もまた使用される。点状は前腹壁の内部性器の投影面積におけるツベルクリン0.1 0.01 TE及びTEの用量で皮内投与後72時間で再び調べました。結核のプロセスに有利には、アデノシンデアミナーゼの活性の増加は最初のものと比較して10％以上である。

眼が冒されると、抗原刺激に応答して眼内で起こる焦点反応が検査される。視覚機能の低下を伴う顕著な応答を発現することは望ましくない。最小限の局所反応の評価はしばしば困難であるため、結論の客観化のために、ハプトグロビンまたはアデノシンデアミナーゼの血清中での平行度および成長の程度に方向づけることが推奨される。

すべての生化学的研究は、他の方法と組み合わせて実施すべきである。

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血液凝固システム研究

TBの血液凝固システムの研究状況の関連性は、肺結核の喀血または肺出血を有する患者の数、ならびに結核の外科的処置におけるhemocoagulation合併症の存在によって引き起こされます。さらに、結核に自然に伴う血管内の血液凝固の潜在的な流れは、疾患の経過および化学療法の有効性に影響を及ぼす。

血液抗凝固活性が観察された減少の滲出性炎症成分の肺TB罹患率を有する患者において。生産hemocoagulation血管内炎症性成分が優勢と肺内の特定の病変の低い有病率を有する患者においてわずかに発現しました。喀血及び肺出血状態血液凝固システムと肺結核の患者で異なっている：増加した「構造の」凝固を維持しながら、その終了高さgemoptoe時または直後に低い血液損失を有する患者における血液凝固能の急激な増加は、trombinoobrazovaniyaの重度の強化にあります。大量の失血の患者では、フィブリノーゲンの濃度を下げることを犠牲にして減少凝固能を観察しました。XIII因子活性、血小板数。システムホメオスタシスが発生重大違反の肺結核の限られた形態を有する患者における外科的治療の段階で。pnevmon-またはplevropnevmonektomiiの実行における広範なプロセスの患者は、しばしばの形取ることができDIC、発展「第二の病気を。」

肺結核患者において血液凝固の状態を監視することは、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）の決意、フィブリノゲン、トロンビン時間、プロトロンビン指数と時間と凝固出血時間を行わなければなりません。

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ホルモン研究

現代の実験および臨床観察は、特定の結核性肺炎におけるホルモン状態の変化の存在を示している。抗結核治療と併せて下垂体 - 副腎、下垂体 - 甲状腺系の機能障害および膵臓機能の補正は遺伝子座特異的炎症における線維形成および修復の活性化に寄与することが証明されています。

下垂体-甲状腺系の機能状態は、トリヨードチロニン（Tの血清中の含有量によって判断され₃）、チロキシン（T ₄）、下垂体甲状腺刺激ホルモン（TSH）。これは、不顕性甲状腺機能低下症は、肺結核患者の百分の38から45で検出され、そして最も頻繁にそれが散在し、線維海綿フォームプロセスであると診断されていることが判明しました。これらの同じ形態の下で最も劇的に低減両方Tのレベル₃およびT ₄、及びこれらのホルモンの不均衡は、Tの比率増加の形で存在してい₄ / T _秒。

免疫反応性インスリンの濃度 - 副腎皮質機能は、血清中のコルチゾールのレベル、および膵臓の内分泌機能によって評価されます。感染症の急性期において、内在性コルチゾールおよびインスリンの必要性が増加する。高インスリン血症はまた、身体組織のインスリン抵抗性を証明するが、これは、任意の活性な炎症プロセスに典型的であり、特に特異的である。活動性肺結核を伴う副腎のグルココルチコイド機能の決定は、大部分の患者において大食皮質症の存在を明らかにすることを可能にする。急性期における感染性炎症を有する患者におけるコルチゾールの血液濃度の正常レベルは、用量を、グルココルチコイドの十分な補充療法を保持するための基礎として役立つことができる副腎皮質のグルココルチコイド作用の相対的障害として考慮されるべきです。

肺結核患者のほぼ3分の1は、それらのインスリン血症のレベルがかなり低く、標準の下限に近づき、13〜20％が有意な高インスリン症を観察することができます。相対的な低インスリン症および高インスリン症は、様々な程度の炭水化物代謝の侵害の発生の危険性の高い因子です。膵臓のB細胞の機能的活性のこれらの変化は、結核患者および糖尿病のタイムリーな予防における血糖の定期的モニタリングを必要とする。さらに、これは、結核の複雑な治療においてインスリンの生理学的用量を使用することの便宜性に対するさらなる正当化の役割を果たす。

広範な肺損傷および結核中毒の重篤な症状と甲状腺ホルモンと結核プロセスの厳しいコースを持つ患者での不均衡の高コルチゾール血症及び高インスリン血症の最大の到達範囲の一般的には、低いレベル、。

結核の微生物学的診断

結核患者の特定、診断の確認、化学療法のモニタリングと修正、治療結果の評価、言い換えれば、患者が結核に登録されてから離脱するまでの間に、微生物学的研究が必要です。

すべての疫学プログラムおよびプロジェクトは、細菌排泄物の数の評価に基づいており、結核菌を検出するための検査方法を使用せずに行うことはできません。いわゆる組織化されていない集団の調査では、細菌の侵入者の割合は70以上に達し、検査方法はこの集団群の中の結核患者を識別するのに十分有効な手段となる。

結核を診断するための伝統的な微生物学的方法は、細菌学的および文化的研究である。最新の方法では、PCRの設定である自動システムでの結核菌の培養が検討されています。しかしながら、これらの方法はすべて古典的な細菌学的方法と必ず組み合わされる。

診断物質の収集

検査研究の有効性は、診断物質の品質に大きく依存する。診断物質の収集、保管、運搬の規則の遵守と患者評価アルゴリズムの正確な実施は、結果に直接影響し、生物学的安全性を保証する。

結核の検査には、様々な材料が使用されています。事実に起因TB logkih-最も一般的な結核性病変、痰や取り外し可能な気管気管支の他のタイプを検討した研究のための基本的な材料：エアロゾル吸入した後に得られる上気道分泌物：気管支洗浄液を、気管支肺胞液リンス; 気管支鏡検査により得られた材料、および気管支吸引液、咽頭スワブ、傷や汚れのAlから滲出液から肺内、経気管生検。

患者からの制御された材料の収集が行われると、研究の有効性が高まる。この目的のために、特別に装備された部屋が割り当てられるか、または特別な客室が購入される。物質の収集は危険な手順なので、感染性の安全の規則を遵守しながら研究のための資料を収集する必要があります。

マイコバクテリウム・ツベルクローシスを試験するための材料は、環境の汚染を防ぎ、収集された材料を汚染から保護するために、堅くねじ止めされたキャップを備えた無菌ボトルに集められる。

診断物質を収集するためのバイアルは、以下の要件を満たさなければなりません。

• 耐衝撃性材料から作られていなければならない。
• オートクレーブ中に容易に溶解するはずである。
• 十分な容量（40〜50ml）である：
• 痰採取用の開口部が広い（直径30mm以上）。
• 取り扱いが簡単で透明または半透明であるため、蓋を開けずに採取したサンプルの量と品質を評価することができます。

最適な研究成果を得るためには、以下の条件を守る必要があります。

• 化学療法の開始前に材料を採取する。
• 研究のための材料は、食品および医薬品の朝の摂取前に収集しなければならない。
• 研究のためには、少なくとも3つの朝の痰のサンプルを採取することが望ましい。3日間連続して痰を集める。
• 収集された物質は、できるだけ早く研究室に届けなければなりません。
• 直ちに実験室に送達することが不可能な場合には、4℃の空気温度で48時間以下冷蔵庫に保存する。
• 材料を輸送する際には、バイアルの完全性を注意深く監視する必要があります。

正しく収集された痰は粘液または粘液腐敗性です。試験した痰の最適量は3〜5mlである。

喀痰は医療専門家の監督下で収集されます。痰採取の責任者は、特定の規則の実施に従うべきである：

• 患者に研究の目的と唾液や鼻咽頭粘液ではなく咳をする必要性を説明する必要がありますが、深部呼吸器の内容物です。これは、数回（2〜3回）の深呼吸の後に生じる生産的な咳の結果として達成され得る。口腔内で生育する微生物叢の主要部分や喀痰の検査を妨げる食物残渣を除去するために、口をすすぎ水ですすぐ必要があることを患者に警告することも必要です。
• バスローブと帽子に加えて、痰採取に参加する医療従事者は、マスク、ゴム手袋、ゴム製エプロンを着用しなければならない。
• 患者の後ろに立つと、彼は瓶を可能な限り唇に近づけ、咳がするとすぐに痰に分け、気流が保健師から遠ざかるように指示する必要があります。
• 痰採取が完了すると、医療従事者は蓋で瓶を慎重に閉じ、採取した痰の量と質を評価する必要があります。その後、ボトルにラベルを貼り、実験室への輸送用の特別なビックスに入れます。

または収集するために、部屋に設置された装置を使用して刺激性の吸入を適用する - 患者は彼に去痰:.マシュマロの根の抽出物（mukaltin）、ブロムヘキシン、アンブロキソール、などを与えるために必要な材料の収集の日に前と朝早くから夜、痰を生産していない場合痰。このようにして集められた材料は、保存の対象ではなく、収集日に検査されるべきである。実験室でのその "淘汰"を避けるためには、特別な印をつけるべきである。

微生物学的研究がこの施設で行われない場合、採取された診断物質は、冷蔵庫内での送達と保存剤の使用との間の間隔で保存される限り、研究所に一元的に送達されるべきである。簡単に消毒することができる輸送用ボックスで材料を検査室に届けます。各サンプルには適切なラベルを付ける必要があり、ロット全体に付随する書式を記入する必要があります。

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患者の検査のモードと頻度

最初の、いわゆる診断、結核患者の検査では、少なくとも3つの喀痰部分を2または3日間検査する必要がある。医療従事者の監督下で収集され、顕微鏡検査の有効性が向上する。

結核の1次スクリーニングは、医療制度のすべての医療診断機関によって実施されるべきである。最近では、現代の顕微鏡と流行の安全のための設備を備えたいわゆる顕微鏡センターが、臨床診断研究所に基づいて組織され、初期検査の効率を改善している。

抗TB施設では、3日間少なくとも3倍の痰検査または他の診断物質を含むスクリーニング検査が使用される。治療中、微生物学的研究は、集中的な化学療法段階の間に、少なくとも月1回定期的に実施される。治療の段階への移行時には、研究の頻度は2〜3ヶ月と少なく、頻繁に行われます。

肺外結核に対する診断物質の収集の特徴

微生物学的研究のより高感度な方法を必要とすることで結核菌の低濃度、主に播種技術媒体上 - TBの肺外形態と病理学的材料を備えています。

尿生殖器系の結核では、尿が最も入手しやすい試験材料です。尿収集は特別に訓練された看護師が行うべきである。

外性器は、石鹸または過マンガン酸カリウムの弱い溶液で水で洗浄されます。尿道の外部開口部は注意深く処置される。滅菌バイアルでは、朝の尿の平均部分が収集されます：男性では、自然に、女性では、カテーテルを使用します。腎盂からの尿は、1つまたは2つの腎臓のカテーテル挿入（後者の場合、必ずしも各腎臓とは別に）の滅菌チューブに集められる。少量のこの尿を遠心分離し、沈降物を検査する。

男性、精子、睾丸精巣では、前立腺の秘密を遠心分離して沈殿物を得る。前立腺マッサージは、男性の生殖器領域における特定のプロセスの局在化によって、結核菌を含む分泌物の分泌を促進することができる。

女性の月経血は、カフカ（Kafka）キャップを吸ったり、使ったりして収集されます。得られた物質から赤血球を除去し、蒸留水で洗浄した後、遠心分離する。沈殿物を調べる。

子宮の頚管からの割り当ては、カフカの容量またはキャップによって収集されます。つまり、1〜2 mlの病理学的物質を蓄積することが望ましいです。

腎臓、性器の手術介入から得られる材料。生検、子宮内膜からの掻爬、ホモジナイズ。これを行うために、それを滅菌モルタルに入れ、滅菌はさみで完全に粉砕する。このスラリーに、その重量に等しい量の滅菌川砂を加えた後、0,5-1.0 mlの等張性塩化ナトリウム溶液で補充し、すべてが等張性塩化ナトリウム溶液（4-5 ml）を添加してペースト状の塊になるまで粉砕しました。次に、塊を1〜1.5分間沈降させ、上清を調べる。

骨や関節の結核。無菌注射器で得られた点滴（膿瘍の膿瘍）を滅菌皿に入れ、直ちに実験室に送達する。あらかじめ滅菌等張性塩化ナトリウム溶液で湿らせた滅菌ピペットを2〜5mlの膿に分け、ビーズの瓶に移し、さらに2〜3mlの等張性塩化ナトリウム溶液を加える。ボトルをコルクで閉じ、ジョーカー装置で8〜10分間振とうする。ホモジナイズした懸濁液を試験する。

骨関節性結核の瘻孔の形態では、瘻からの膿が採取される。多量の排出物は試験管に直接集められる。ケースでは、リーン歯槽膿漏瘻は、無菌の等張性塩化ナトリウム溶液で洗浄し、洗浄液を試験管、または分析のために送られた膿を含浸させたタンポンの部分に集めました。

骨および関節に対する外科的介入中に得られる外科用材料は、膿性壊死塊、顆粒、瘢痕組織、骨組織、滑膜組織および他の基質からなることができる。その治療は、腎臓の結核と同様に行われる。

凝固を防ぐためのクエン酸ナトリウムの3％溶液（1：1比）中の滑液の微生物学的検査は、穿刺直後に行われる。

リンパ節の結核。リンパ節の穿刺中に抽出された膿も検査される。膿瘍の膿として。外科的介入中に得られたリンパ節の組織、生検は、他の形態の結核と同様に検査される。

マイコバクテリウム・ツベルクローシスでの大便の研究は、殆ど肯定的な結果がほとんどないため、極めてまれである。

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マイコバクテリウム顕微鏡法

喀痰検査は、結核が疑われるすべての症例に使用すべき、比較的迅速で簡単で安価な方法である。さらに、この試験は、化学療法の有効性を評価し、培養試験がない場合の治療の回復または失敗を確認するために実施される。

顕微鏡検査の2つの方法が使用される：

• スメアが診断物質から直接調製される場合、直接顕微鏡検査の方法;
• 培養のための除染剤処理された材料から調製された沈降物の顕微鏡検査法。

第1の方法は、顕微鏡検査のみが行われる検査機関（一般的な医療ネットワークの臨床および診断研究所）で使用される。

顕微鏡検査の最良の結果は、診断物質を濃縮することによって（例えば、遠心分離によって）得られる。

顕微鏡検査を行う際に50％の確率で結核菌を検出するには、1mlの喀痰に5000以上の微生物細胞を含める必要があります。肺型の結核患者の喀痰には、通常、相当量の酸不安定な細菌が含まれているため、細菌検査で確実に検出できます。この方法の診断感度は、1人の患者からのいくつかの喀痰試料を検査することによって改善することができる。一部の患者の喀痰には顕微鏡検査で検出できるよりも少ないマイコバクテリアが含まれているため、細菌検査ではマイコバクテリアの検査結果が陰性であっても結核の診断は除外されません。喀痰塗抹検査の不十分な準備はまた、細菌検査の陰性の結果を引き起こす可能性がある。

スミア中の酸高速ミコバクテリアの検出のための最も一般的な方法は、チオール - ネルセンによる色である。この方法は、アルコールの脂質層を含む膜を介して、フェノールの強力なエッチング作用と同時に、炭水化物のフクシンの微生物細胞への浸透に基づく。硫酸または3％塩酸の25％溶液によるスメアのその後の変色は、全ての非酸性構造の変色をもたらす。スメアの変色した要素をメチレンブルーの0.3％溶液で染色する。マイコバクテリアは通常のアニリン色素を認識しません。その結果、酸性速いマイコバクテリアは真紅赤色に染色され、その他の微生物や細胞要素は青色で染色されます。

チール・Nelsenuによって染色塗抹標本のための油浸レンズ（90-又は100倍増加）および7-又は10倍の倍率の接眼レンズの光双眼顕微鏡を使用します。100の視野を探索します。これは、塗抹標本内の単一のマイコバクテリアを識別するのに十分です。このような調査の結果が否定的である場合、確認のために、別の200視野を見ることが推奨される。検出された酸高速桿菌（KUM）の数を示す結果を記録する。

この技術に加えて、色蛍光色素が発光顕微鏡法に用いられ、最良の結果が得られる。この方法の使用は、顕微鏡の効率を10〜15％増加させる。マイコバクテリアを発光色素（オーラミン、ローダミンなど）で処理する場合、これらの物質はまた、微生物細胞のワックス様構造に結合する。着色された細胞に励起光源（ある種の紫外線のスペクトル）を照射すると、黒または暗緑色の背景にオレンジ色または明るい赤色の光で輝き始めます。可視像の高輝度およびコントラストにより、顕微鏡の全体的な倍率は4〜10倍に縮小され、視野が広がり、調製物の視認時間が減少する。これに伴い、より深い被写界深度のために、研究の快適性を高めることができます。

同じ領域をスキャンするために蛍光顕微鏡法を用いる場合、スミアは、チオール - ネルセン染色の光学顕微鏡法よりも著しく少ない時間を費やす。もし作業日に顕微鏡が約20-25のそのような塗抹標本を検査すれば、蛍光顕微鏡検査の助けを借りて、彼は同時に60-80標本以上を検査することができる。経験豊富な顕微鏡使用オーラミンおよびローダミンの混合物を用いた細胞の色は、この場合、ゴールデンロッドで抗酸菌用幾分特異的であることを知っています。腐朽菌は緑色に塗られている。

蛍光顕微鏡の方法のもう一つの重要な利点 - 変更されたマイコバクテリアを検出する能力は、強力な化学療法、kislotousotoychivostiプロパティと、この染色ジールNelsenuに関連して検出されないなどの不利な要因の影響を受けて失われました。

蛍光顕微鏡法の欠点は、顕微鏡およびその操作のコストが比較的高いことである。しかし、3つの従来の顕微鏡で作業する3人の実験技師の標準を超える集中型または他の大規模な実験室では、代わりに1つの蛍光顕微鏡を使用する方が安価です。

細菌検査法は、かなり高い特異性（89〜100％）を有する。いずれの顕微鏡検査法によって得られた陽性結果の約97％は、播種の結果によって明白に確認されている。

病理学的物質の塗抹標本を顕微鏡で検査する場合、同定された酸性速いマイコバクテリアに属する種を決定することは不可能であることに留意すべきである。顕微鏡法は、結核性マイコバクテリア複合nontubercular酸耐性微生物に形態学的に類似の多数の自然に存在によって説明することができる微生物の調製物中の酸の存在下又は非存在下、上の意見を与えることを可能にします。

顕微鏡検査の結果は、半定量的単位で評価される。

顕微鏡法の異なる方法の結果を比較することができるようにするために、経験的係数が導入される。例えば、蛍光色素で染色された塗抹標本の結果を比較するために、データの研究光顕微鏡（1000倍の倍率）、それは蛍光顕微鏡によって検出された抗酸菌の数を分割する必要があり、250倍の倍率に対応する係数 - 10、 450倍~4倍、630倍~2倍。

肺外結核に対する顕微鏡検査の特徴

直接顕微鏡検査、ならびに濃縮後に調製された塗抹標本の顕微鏡検査、続いてチオール - ネルセン染色または発光色素が行われる。スミアの直接顕微鏡検査は、材料中のマイコバクテリアの濃度が低いため効果がなく、したがって、濃縮方法を使用する方が合理的です。最も効果的なのは遠心分離です。生物学的材料が粘性である場合、遠心分離は、3000グラムと次亜塩素酸溶液の遠心力で高速遠心機を用いて行われる材料、の同時液化及び均質化が印加されます。マイクロ浮選のような濃縮の他の方法は、生物学的に有害なエアロゾルの形成のために現在使用されていない。

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結核診断の文化的方法

播種の方法、または培養方法は、スメア顕微鏡法よりも敏感であり、後者に対していくつかの利点がある。それは、試験材料中の数十の生存可能なマイコバクテリアを検出することを可能にし、大きな診断値を有する。これは、少量のマイコバクテリアを放出する新たに診断されたまたは治療された患者からの材料を試験する場合に特に重要である。

疾患が依然として治療によく反応した場合には、顕微鏡と比較して、培養物をより15から25パーセントによって結核の検出されたケースの数を増やすことができ、ならびに初期段階における結核の検証。培養試験の非常に重要な利点は、薬物感受性、病原性および他の生物学的特性に関して同定および研究され得る興奮性培養物を得る可能性である。

栽培方法の欠点は、その持続時間（材料の待ち時間が10週間に達する）である。高価であり、診断材料の処理の複雑さ。

診断物質の前処理の原則

従来の微生物学的方法は、結核に関する研究を行う際には使用できない。これは事実によるものです。マイコバクテリウム・ツベルクローシスは非常にゆっくりと増殖し、ほとんどの臨床試料は急速に増殖する発育性および腐敗性の微生物、菌類を含む。豊富な栄養培地でのそれらの急速な成長は、マイコバクテリアの発生を妨げ、結核の原因物質を単離することを可能にしないので、診断物質は、播種する前に前処理しなければならない。さらに、患者の気道から放出されたマイコバクテリアは、通常、大量の粘液に囲まれており、集中することが困難である。この点で、痰や他の同様の材料を植える前に、それらの液状化、汚染除去が必要です。

すべての洗剤およびデノテタミンは、マイコバクテリアに対して多かれ少なかれ顕著な毒性効果を有する。処理の結果、90％までのマイコバクテリアが死ぬ可能性があります。材料中に存在するマイコバクテリアの生存能力を維持するために - 一方で、急速に成長して化膿性細菌や腐敗を抑制し、他の上、許可処理技術を使用する必要が温存、マイコバクテリア人口の十分な維持するために。

材料、種々の除染剤を用いて前処理するための均質性および汚染の程度に応じて：痰 - 4％水酸化ナトリウム溶液を、溶液は、リン酸ナトリウム10％、塩化ベンザルコニウム、リン酸三ナトリウム、NALC-NaOHを（N-アセチル-L-システインをtrohzameschonnogo硫酸溶液は3％、汚染されたサンプルについて、脂肪含有材料 - - 5％シュウ酸の溶液尿及び他の液体材料中の1％のNaOHの最終濃度で水酸化ナトリウム）。さらに、いくつかの場合、酵素、界面活性剤（界面活性剤）が使用される。アプリケーショントゥイーン洗剤や他のいくつかのマイコバクテリア死は（40から50パーセントが生き残る）より少ない細胞を伴っています。しかし、液体材料にしか使用できません。世界最大の流通量はNALC-NaOHでした。セットで生産される。この方法は、マイコバクテリア細胞集団の85％以上を割り当てることを可能にする。除染tkanesoderzhaschih固体は硬い均質化中の材料の分散度が難しいため、推測することができます。例えば、リンパ節の治療生検は、多くの場合、外来微生物叢による汚染の頻度の増加を伴います。この場合、1％のエトニウムを使用することができる。

非均質材料を、汚染除去剤の存在下でガラスビーズで均質化する。液体材料は予め遠心分離され、沈殿物のみが処理される。

播種およびインキュベーション技術

前処理後、材料を遠心分離し、それによって、マイコバクテリアを沈殿させ、沈降物中のそれらの含量を増加させる（「スラッジ富化」）。得られた沈殿物を中和し、高密度栄養培地または液体（半液体）培地を含むチューブで接種（接種）する。残りの堆積物から、顕微鏡検査のために塗抹標本を調製する。シーディング技術は、診断物質の交差汚染を防止すべきである。

微生物学的研究の結果の信頼できる臨床的解釈のために、以下の規則を遵守しなければならない。微視的および培養研究は、診断物質の同じ試料から並行して行わなければならない。

接種した試験管を37 ^℃の恒温槽に2日間水平に置きます。これにより、培養培地への材料のより均一な吸収が保証される。2日後、チューブを垂直位置に移し、ゴムまたはシリコーンプラグで気密封止し、播種した培地の乾燥を防止する。

作物は37でインキュベートさ^について定期的に毎週見ると、10〜12週間C。プレビューごとに、以下のパラメータが記録されます。

• 播種の日から視覚的に観察された期間;
• 成長率（CFU数）。
• 外来微生物の菌叢または真菌による作物の汚染（そのような管は除去される）;
• 目に見える成長の欠如。チューブは、次の観察までサーモスタット内に放置される。

栄養培地

マイコバクテリアの培養には様々な栄養培地が用いられる。高密度、半液体、液体。しかしながら、既知の栄養培地のいずれも、全てのマイコバクテリア細胞の増殖を確実にする性質を有さない。これに関連して、異なる組成の2〜3の栄養培地を同時に使用して有効性を高めることが推奨される。

WHOは、結核の原因物質の一次単離とその薬剤感受性の決定のための標準的な培地としてLevenstein-Jensen環境を推奨している。これは、細菌検査で陽性の材料を播種した20〜25日目にマイコバクテリアの増殖が得られる密な卵環境である。細菌学的に陰性の材料の作物は、より長い潜伏期間（10-12週間まで）を必要とする。

我々の国では、提案されたE.R. フィン卵環境フィンII。それは、L-アスパラギンの代わりにグルタミン酸ナトリウムを使用し、マイコバクテリアのアミノ酸を合成する他の方法を引き起こす点が異なります。若干早くこの培地に増殖が見られ、マイコバクテリアの分配頻度はLowenstein-Jensen培地より6〜8％高い。

肺外結核の細菌学的診断の有効性を改善するために、改変Finn-II培地を栄養培地の複合体に含めることが推奨される。増殖を促進するために、酸素の濃度を低下させる0.05％のチオグリコール酸ナトリウムを、Finn-II栄養培地に追加添加する。0.001マイクログラム/ mlの濃度で栄養培地フィン-II投与酸化防止剤αトコフェロールアセテートにおける脂質過酸化のマイコバクテリウム系毒性産物から酵素を保護します。診断物質の播種は、標準的な手順に従って実施される。

ロシアの結核対策研究所では、高濃度の栄養培地の他の改変も使用されている。G.G. V.Aによって開発されたモルドビアン栄養培地「New」。アニス栄養培地A-6、A-9等

化学療法の過程で微生物細胞の種々の代謝系への損傷であるという事実のために、いくつかのマイコバクテリア集団は、従来の栄養培地中で正常に発育する能力を失い、浸透圧バランス（または半液体）培地を必要とします。

診断材料の播種結果の評価および記録

マイコバクテリアのいくつかの株および種はゆっくりと増殖し、90日目まで成長が見られる。そのような作物の数は少ないが、これはサーモスタットで作物を2.5〜3ヶ月間耐えることを可能にする。

マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）の有害な培養物は、通常、様々なサイズおよび種のR体コロニーの形態で高密度の卵環境で増殖する。コロニーは乾燥し、しわがあり、象牙はわずかに着色している。他の培地では、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのコロニーはより湿っているかもしれません。化学療法の経過後または治療中に、湿潤成長（S型）を有する平滑なコロニーを割り当てることができる。

作物を単離する際には、結核菌と非耐性結核菌を区別するために特別な研究が行われます。

生育したコロニーから染色されたチオール - ネルセンスメアの強制的な顕微鏡検査後に陽性反応が示される。塗抹されたマイコバクテリアの成長の場合には、羽毛または帯状の形態でクラスターを形成する単独または群にある明るい赤色のスティックが見出される。特に化学療法の患者の長期治療から単離された若い培養において、マイコバクテリアが存在するまで、菌糸体に似ている短い、ほぼ球菌または細長いバージョンと共に、棒状、発現多型を異なります。

マイコバクテリアの増殖率は、以下のスキームによって示される：（+） - 1〜20cfu（インビトロでの細菌の排泄）; （++） - インビトロで20-100CFU（中程度の細菌排泄）; （+++） - > 100CFU（インビトロでの細菌の豊富な排出）。結核の検査室診断では、マイコバクテリアが1つまたは別の方法で検出されたかどうかを答えるだけでは不十分です。マイコバクテリア集団の程度および性質、その組成および性質についての詳細な理解を有する。これらのデータは、プロセスの状態を正しく解釈し、戦術を計画し、タイムリーに治療を修正することを可能にします。

近年、マイコバクテリアの増殖を促進するために、様々な生育添加物を用いた寒天ベースの栄養培地と特別な混合ガスの使用が提案されている。これらの培地上でマイコバクテリアの増殖を得るために、培養中に二酸化炭素（4-7％）の高い含量の雰囲気が作り出される。特別なCO ₂インキュベータがこの目的のために使用される。しかし、MGIT-BACTEC-960およびMB / Bactのような、マイコバクテリアの培養のための最も自動化されたシステムが開発されました。

そのようなシステム - MGIT系（マイコバクテリアの成長を示すチューブ）、高い技術の開発を参照して、第一の薬物、およびいくつかの第二選択薬に対する結核およびマイコバクテリウム感受性の迅速な細菌学診断のために意図されています。MGITはVASTES-960デバイスの一部としてそれを使用することに重点を置いています。微生物は、改変されたMiddlebrook-7H9培地に基づく液体栄養培地を用いて特別なチューブで培養される。マイコバクテリアの増殖を刺激し、外来の微生物叢の成長を抑制するために、MGIT Growth SupplementおよびPANTA抗菌薬の混合物が使用される。

微生物の増殖は光学的に記録される。これは、増殖中にマイコバクテリアによって酸素が消費されるときに起こる蛍光に基づいています。酸素flyuorohromny色素特別試験管の底に含まれているとシリコーンの層で覆われました。再生マイコバクテリアは、チューブ内の酸素量の低下や紫外線管によって照射下で見えるようになると自動的に登録された光センサ内蔵アプライアンスVASTES-960蛍光の増加を引き起こす濃度を低減につながります。ルミネッセンスの強度は、成長単位（GU-成長単位）で記録される。成長データはコンピュータに記録され、そこで自動的に保存されます。成長曲線のコンピューター分析は、nontubercularを含むマイコバクテリウム・プールの様々な、の有無についての情報を提供し、また、マイコバクテリアの成長特性を評価するのに役立ちますすることができます。

そのようなシステムの導入の結果、マイコバクテリアの成長時間は、VASTES-960で11日間、MB / Bactで19日間、標準の高密度栄養培地で33日間平均して有意に減少した。これらのシステムには高度な資格のある人員が必要であることに注意してください。液体培地での材料の播種には、必然的にLevenstein-Jensen培地を播種する必要があり、結核菌が他の培地を生み出さない場合にはバックアップの役割を果たす。

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マイコバクテリアの薬剤感受性の測定

抗結核薬に対するマイコバクテリアのスペクトルおよび感受性の決定は、臨床的に重要であり、薬剤耐性を有する結核の疫学的評価にも重要である。さらに、薬物耐性のモニタリングにより、結核対策プログラム全体の有効性を評価することが可能となり、結核対策活動のすべての構成要素のパフォーマンスの不可欠な指標となる。

薬物感受性の多重度とタイミング：

• 治療の戦略と戦術を決定するための治療の開始前に：
• 様々な材料（痰、BAL液、尿、滲出液、酒類など）からの病気の培養物から単離された場合、全ての単離された株が検査される：
• 臨床的および放射線学的動態が存在しない治療の集中段階の終わりに：
• 以下の場合に治療計画を変更する必要がある場合：
  • 喀痰塗抹の欠如;
  • 喀痰塗抹陰性の後の培養物の再単離;
  • 最初の減少後の綿棒のCMU数の大幅な増加。結核患者は、薬剤感受性に関して異種である結核菌株が単離されていることはよく知られている。抗結核薬に対する菌株の感受性は、薬剤のスペクトル、程度、頻度および耐性発生率が異なる場合がある。

結核菌の薬剤耐性の程度は、抗結核薬、その薬物動態、病変内の濃度の活性に依存し、臨床的意義および安定性に焦点を当てている確立された基準に従って決定しました。最大治療用量などである。

マイコバクテリアの薬剤感受性の測定は、現在、微生物学的方法によって行われている：

• 絶対濃度（高密度または液体栄養培地での希釈法）、
• 比率、
• 抵抗係数。

通常、耐性は、結核菌のコロニーの肉眼で観察される増殖の形で現れるが、発色反応の形でマイコバクテリアの細胞分裂の初期段階で増殖を誘導する方法がある。これらの方法は、試験時間を3〜4週間から2週間に短縮する。

ロシアで統一されるように、ビューの方法論の点から絶対濃度のWHO会議化学療法法が推奨する、拡張最も単純であるが、それは高精度と実験手順の標準化を必要とされています。DSTは、栄養培地、修飾抗結核薬とチューブのセットからなります。セットは、環境及びナトリウムのSalI tsilovokislogo又は500マイコバクテリアの増殖を検出するためにUG / mlのparanitrobenzoynoy酸nontubercular 1000マイクログラム/ mlを含むつのチューブに薬物なしで使用される薬物のそれぞれの濃度が異なる2-3チューブ、一つの制御チューブから成ります。

調製物を含む培地のセットを調製するために、改変Levenstein-Jensen培地（デンプンなし）を使用し、これをフラスコに注ぐ。各フラスコに、抗結核性製剤の特定量の適切な希釈液を加える。フラスコの内容物を完全に混合し、管に注ぎ、85℃の温度で40分間傾斜した位置で折り畳む。自動温度制御付きの巻戻し機内でメディアを巻くことを推奨します。水曜日に抗結核薬で

1段目は2〜4℃の冷蔵庫に1ヶ月間保存でき、2列目は2週間以内で保存できます。室温での調製物による媒体の保管は受け入れられない。抗結核薬の溶液を調製する場合、それらの活性を考慮して、製剤の非特異的部分の分子量、純度などを調整した濃度を計算する。薬物感受性を決定するために、化学的に純粋な物質のみが使用される。

この方法の原理は、マイコバクテリア集団の重要な部分の成長を阻害する抗結核薬の濃度を決定することである。正しく行われた場合、この方法は信頼性が高くなります。

試験の前に、結核菌の単離された培養物に外来の微生物叢がないことを確認することが必要である。0.9％塩化ナトリウム溶液中のマイコバクテリアの培養物から、1mlあたり5億個の微生物体を含有する均質懸濁液を調製する（5単位の光学濁度標準）。得られたスラリーを0.9％塩化ナトリウム溶液（1:10）で希釈し、0.2mlのスラリーを培地セットの各チューブに加える。接種された管は、媒体の傾斜面が均一に結核菌の懸濁液を接種し、37℃のインキュベーターに入れ、2-3日間水平に保持しました。次いで、チューブを垂直位置に移し、3〜4週間インキュベートする。結果は3〜4週間後に記録される。

栄養培地上での臨床物質からの排出排泄のタイミングは少なくとも1〜1.5ヶ月であるので、この方法による薬剤感受性の決定の結果は、材料の播種後2〜2.5ヶ月以内に得ることができる。これは、この方法の主な欠点の1つである。

特定の基準に基づいて、マイコバクテリアの薬物感受性を決定した結果を解釈する。この薬物とインビトロで増殖させたマイコバクテリアのコロニー数は薬物を含まない対照チューブに豊富な成長と20以下である場合、固体培地上で、培地中に含まれる薬物の濃度に敏感であると考えられます。20以上のコロニーの存在下でのみ、培養物はこの濃度に耐性であるとみなされる。実際には、増殖を得ると、20cfuに近い試験管が得られる。この場合、感受性や耐性が境界線であることを臨床ユニットに通知する必要があります。臨床指標のあいまいなダイナミクスを説明できることがあるためです。

種々の薬物について、特定の濃度が確立され、そこでは、ミコバクテリア集団の重要な割合の再現が観察される。これらの濃度は「臨界」と呼ばれます。安定性の基準として、臨界濃度の調製物を含む栄養培地上でのマイコバクテリアの集団の増殖が使用される。

国内結核対策では、薬物耐性を決定する上で、重要な濃度のみを決定することに限定されない。これは事実によるものです。薬剤耐性の拡張定義レベルは、臨床医がより正確に薬物の組み合わせの作用を増強するの知識を使用して戦術化学療法を配置することを可能にすることを、抵抗を期待十字又は抗TB薬物を用いるより効果的な薬物群を適用します。

絶対濃度法は最も簡単ですが、実行時の誤差に対して最も敏感です。より信頼性の高い、特にセカンドラインの薬への感受性を決定する際に、そしてロシアの共通の外は比率の方法です。これは、絶対濃度法の欠点を考慮に入れますが、実行すると面倒です。

この方法は、絶対濃度法と非常によく似ています。薬剤を含む試験管の調製も同様に行う。絶対濃縮法の場合と同様である。しかし、結核菌懸濁液の種子投与量は10倍に減少する。これは、結核菌のいくつかの菌株がEtambutol、protionamide、capreomycinなどの薬剤に自発的に抵抗する頻度を排除します。対照として、試験管中で同等の種子投与量を有する2本または3本の試験管を連続的に10倍および100倍希釈したものを使用する。安定性の基準は、視覚的に観察される結核菌の増殖の割合である。第1シリーズの薬剤については、第2列の薬剤について、選択された臨界濃度に依存して、初期の1％またはそれ以上の増加であり、安定性基準は最初の集団の1％の過剰成長である。

1997年には、優れた結核結核薬剤耐性の識別のための国際連合のワーキンググループは、以下の濃度で固体卵メディアローウェンスタイン・ジェンセンに育つと考え耐性マイコバクテリアを、提供し、これらの基準に調整を行っています。

• ジヒドロストレプトマイシン-4μg/ ml;
• イソニアジド0.2μg/ ml：
• リファンピシン40μg/ ml：
• エタンブトール - 2μg/ ml。

2001年には、以下の第2選択薬（臨界率1％）の致死濃度が提案された。

• カプレオマイシン-40mcg / ml;
• プロトンアミド - 40mcg / ml;
• カナマイシン-30μg/ ml;
• ビオマイシン-30mcg / ml;
• サイクロセリン40μg/ ml;
• アミノサリチル酸-0.5μg/ ml;
• ofloxacin - 2μg/ ml。

成長の結果は、予備として4週間後および培養の6週間後に最終的なものとして評価される。

現代の化学療法で広く使用されているピラジンアミドに対する薬剤感受性を決定するために、推奨される臨界濃度は200μg/ mlである。しかし、依然として酸性媒体中でのみ発揮されるため、その抗菌活性の固体栄養培地上で、この薬剤に対する耐性を決定するための一般に認められた方法は存在しない（pHが<6）、維持することが技術的に困難です。さらに、マイコバクテリアの結核の多くの臨床培養物は、酸性環境を有する卵環境では消化しにくい。

マイコバクテリウムの薬剤感受性試験の結果の品質を評価するために、媒体LJの各新バッチを、標準的な博物館株菌H37Rvの感度の平行決意を制御することをお勧め。さらに、技術が良好に再現可能かつ正確に解釈される結果をもたらすように維持しなければならない微生物学的基準がある。これらは、結核菌の培養物の生存性、結核菌の選択規則の均一な懸濁液と懸濁培養物を得るためのルール、選択された細菌塊の代表を含みます。非常に希少な細菌の放出により、薬剤耐性の決定の信頼性が低下する。

近年、自動システムを用いて薬物感受性を決定する方法が有望視されている。この分野で最も完璧なのは、VASTES MGIT-960に基づく開発です。この場合、結核菌の薬剤感受性は、変更された割合の方法に基づいて決定される。測定の過程で、コントロールチューブおよび薬剤を含む試験管におけるマイコバクテリウム結核の増殖率を比較する。ストレプトマイシン、イソニアジド、サンゴ礁pitsinuおよびエタンブトールに対する感受性を決定するために、添加剤および抗生物質を豊かに使用されると、設定されたSIREキットに含まれます。ピラジンアミドに対する感度を決定するには、PZAキットを使用します。ピラジナミドを除くすべての薬物のために再構成懸濁液と薬物との懸濁試験結核菌接種試験管、並びに対照チューブのコースの100倍で、前記懸濁液は、10倍の希釈です。安定性の基準は、マイコバクテリアの成長指標値100 GUである場合、制御チューブ400 GU（CM。「マイコバクテリアの単離方法の文化」）で成長。結果の会計および解釈は自動的に実行され、入力または選択されたプログラムによって設定されます。

臨界濃度として、液体栄養培地を含む試験管に最終濃度を使用する。現在、第一選択薬および第二選択薬の両方について致死濃度が開発されている。サイクロセリンおよびアミノサリチル酸に対するマイコバクテリアの結核の感受性は、卵の栄養培地においてのみ決定されることに留意すべきである。

精巧な作業プロトコルに記載したシステムは、専用の培養（密な栄養培地）などの薬物感受性を研究することができ、in vitroで一次マイコバクテMGIT成長を使用して。伝統的な方法は、唯一の第三の月得ることが可能である一方、後者の選択肢は大幅に、あなたが材料の採取日から3週間後（薬剤感受性に関する情報を含む）、結核菌の文化の完全な結果を得るためにできるように、文化のための時間が短縮されます。患者が集中的な治療段階にあるときに得られた結果は、比較的高額の研究費を補うことができる。

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マイコバクテリアの分化

使用された栄養培地が厳密に選択的ではないことを考慮に入れて。単離されたマイコバクテリアのその後の分化は必須であると認識される。結核及び抗酸菌の別のコースと結果、いくつかの抗結核薬への自然な薬剤耐性の有無：マイコバクテリアの分化の必要性は属によって引き起こされる病理学的プロセスの機能の数によるものです。

結核菌群Mのnontubercularマイコバクテリアからの一次識別は、次の特性によって行われることが認識されている：固体栄養培地、色素沈着、コロニー形態、耐酸性及び温度最適増殖の存在に成長率。

残念ながら、確実M.、他の抗酸性桿菌から複合マイコバクテリア結核区別する単一の実験室の方法が存在しない、それにもかかわらず生化学的試験の数の下に与えられた結果を用いて上述した特徴の組み合わせは、おそらくにMと結核菌複合体の同定を可能にします95％。

以下の症状の存在を検出nontubercular基本的な生化学的試験を用いる遅い成長マイコバクテリアからマイコバクテリウム複合結核菌の分化（結核菌、M。ボビス、M。bovisBCG、M。africanum、M。ミクロチ、M.のcanettiiなど）のために：

• ニコチン酸を生成する能力（ナイアシン試験）：
• 硝酸レダクターゼ活性;
• 熱安定性カタラーゼ;
• サリチル酸ナトリウム（1mg / ml）を含む培地上での増殖。

さらなる試験として、500μg/ mlのパラニトロ安息香酸または5％塩化ナトリウムを含む培地上での増殖もまた使用することができる。

多くの細菌学研究所は、これらの微生物を、複合体のレベルでのみ同定する。これは、実験室の能力が限られており、専門家の方法論的能力のためである。

硝酸塩の存在のためにナイアシン、プレゼンス登録及びチオフェン-2-カルボン酸の2 UG / mlのヒドラジドを含有する培地中でpirazinamidazy成長：ほとんどの場合、しかし、実際には、ヒト型結核菌およびM.ボビスを区別するため、以下の試験に十分です。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（M. Tuberculosis）複合体のマイコバクテリアは、以下の一連の特徴を特徴とすることが考慮される：

• 遅い成長（3週間以上）;
• 範囲35〜37の成長温度^入出力 C。
• 色素沈着の欠如（アイボリー）;
• マークされた酸高速色;
• 陽性ナイアシン試験;
• 陽性硝酸還元酵素試験;
• 熱安定性カタラーゼの欠如（68 ^℃）。
• Levenstein-Jensen培地上での増殖の欠如：
  • 1000μg/ mlのサリチル酸ナトリウム、
  • 500μg/ mlのパラニトロ安息香酸、
  • 5％塩化ナトリウム：
• 1-5μg/ mlのチオフェン-2-カルボン酸の存在下で増殖させる。

単離されたマイコバクテリアの分化の関連性は、結核またはマイコバクテリア症に関連するHIV / AIDS症例の記録頻度の増加とともに著しく増加するであろう。現時点では、この量の作業を正しく実施するための現実的な地域研究所の準備が確実であるということは絶対にありません。

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結核の免疫学的診断

もともと結核またはマイコバクテリアに対する免疫応答のモデルでそれを発見された普遍的な現象、薬や免疫学的試験の数があります。（ - Pirquetとマントー反応ツベルクリン）、皮下ツベルクリン感作動物の反応（コッホ現象）これらは、BCGツベルクリン、皮膚DTHなどの現象を含みます。感染症の最初の抗体の1つは、結核でも検出されました。もちろん、良い結核免疫のメカニズムとその遺伝的制御の理解深め、より大きなTBの実用的な問題を解決するために、免疫系に影響を与える免疫学的方法や薬の使用も可能。

最も重要かつ困難な現実的な問題は、現在、集団の集団スクリーニングのプロセスにおける結核の検出と考えられている。しかし、「成功」（限られた材料）に関する多数の報告にもかかわらず、適切な免疫学的方法（「任意の腕」に再現可能）およびこの目的に適した薬物は存在しない。

免疫学的方法、特に血清学的試験（抗原、抗体の測定）およびツベルクリン誘発試験は、臨床診療において非常に広く使用されている。

第一に、鑑別診断で使用される免疫学的研究の中には、血清学的方法、すなわち体の異なる環境における抗原および抗体の決定がある。

マイコバクテリアの結核に対する抗体の特異性は、イムノアッセイで使用される抗原に依存する。かなりの量の抗原が提案され、その最初のものはツベルクリンPPDである：

• 培養液からのPAPおよび他の複合体調製物;
• 超音波破砕;
• トリトン抽出物および他の細胞壁の複雑な調製物;
• 5抗原（Daniel）;
• 60抗原（Coccito）;
• リポアラビノマンナン;
• コード因子（トレハロース-6,6-ジコハク酸）。
• フェノールおよび他の糖脂質;
• リポ多糖;
• フィブロネクチン結合抗原;
• タンパク質（ほとんどの場合、組換え）; 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDAなど

より複雑な抗原、より高感度とテストの下特異性：ロシアと外国の科学者によって、長年の研究の結果、基本的な法律や結核の抗体血清学的診断の有効性を明らかにしました。異なる国の特異性は、結核菌感染とBCGワクチン接種などを運ぶからnontubercularマイコバクテリアの集団に依存して変化する。小児では、血清診断の情報量は、成人におけるよりも低いです。原発性結核（より多くの場合、小児）では、IgMの定義がより有益である。二次IgGと反応する。HIVに感染した患者では、抗体検査における血清診断の有益な価値が低下する。プロセス・アクティビティ（空洞の「単離」マイコバクテリア存在減衰、浸潤の程度の存在または非存在）、プロセスの有病率は、その流れの持続時間：抗体の効率決意「は、臨床的側面」の数に依存します。

酵素イムノアッセイ（ELISA）法の感度は約70％である。この研究の有効性が十分でないのは、その特異性が低いためである。以前は、高リスク群、特に肺の結核後の変化を有する人々の血清学的スクリーニングの可能性が考慮されていた。

ELISAの特異性を高めるために、遺伝子工学によって得られた抗原（ESAT-6など）（上記参照）を含むより特異的な抗原の検索が継続される。厳密に特異的な抗原（38kDa、ESAT）の使用は、特異性を増加させる。分析の感度を著しく低下させる。IFA（実験室試験システム。例えばPathozyme ELISAキット）と一緒にも横イムノクロマト濾過（Mycodot）、並びに試験結果の視覚的評価を有する他の同様の試験（膜上のドット解析）を有するキットを提供します。これらの試験の間、分析は10〜30分間実施される。彼らは特別な機器を必要としません、彼らは特定の主観性に関連付けられている結果の視覚的評価が必要です。これらの方法は、従来のELISAとほぼ同じ感度および特異性特性（それぞれ70％および90〜93％）を有する。

イムノアッセイ法の使用は、追加の方法において考慮錯体、特にそれの肺外形態の診断におけるTBの鑑別診断、などの特定の値を有します。最も効果的なELISA法は、脳脊髄液の研究における結核髄膜炎の診断にある。この場合、分析の感度は80〜85％であり、特異度は97〜98％である。結核性膀胱炎の診断には、涙液中の結核菌に対する抗体の検出の有効性に関するデータがあります。

インビトロでのガンマインターフェロン合成の誘導

ガンマインターフェロン（IFN-γ）は、マクロファージ酵素系を活性化することによって実現される特異的免疫防御因子である。感作されたTリンパ球によるIFN-γ合成の誘導は、マイコバクテリアの抗原とのそれらの相互作用を引き起こす。

ツベルクリンPPDとして使用される抗原として。遺伝子工学によって得られた、特定の抗原、特に抗原ESAT-6（分子量6キロダルトンを有する早期分泌抗原）及びCFP-10（培養濾過液タンパク質10 kDaの）。BCGワクチンおよび他のマイコバクテリアの細胞には、遺伝子工学または組換え抗原は存在しない。ツベルクリンを使用する場合、誘導試験IFN-γの結果は、ツベルクリン皮膚試験（直接相関）の結果と同等である。遺伝子操作された抗原を使用する場合、試験結果はより特異的であり、BCGの以前のワクチン接種に依存しない。結核感染と接触していないワクチン接種者を試験する場合、試験の特異性は99％である。結核患者の検査感度は81〜89％である。

テストおよび診断ツールは、IFN-γ濃度のその後の決意と結核菌のin vitroの抗原またはIFN-γを合成するTリンパ球の数をカウントすることにより血液から単離された細胞又は全血単核細胞の短期培養に基づいて開発されてきました。インビトロで合成されたインターフェロンの濃度は、IFN-γの結合モノクローナル抗体を用いたELISAにより決定しました。次いで、試験管またはプレートのウェル中の濃度によって決定IFN-γの較正標準を使用。

Elispot試験を行う場合、IFN-γを合成するTリム球の数。IFN-γに対する抗体で被覆されたプレートの表面上で計数する。

医薬品や米国製品のための機関によって承認された誘導によりIFN-γのin vitroでの開発者Diagnosticumは、テストが活動性結核から潜伏結核感染を区別することは不可能であると主張しています。したがって、感染レベルの高い地域では、検査は直接診断ではありません。しかし、私たちの国では、子どもの結核感染とワクチン接種後のアレルギーとを区別し、治療過程における特異的免疫のレベルを評価するために使用することができます。

現在、特定の結核抗原によるインビトロでのIFN-γ合成の誘導を決定するための国内試験系が研究されている。

結核、免疫矯正の免疫状態および経過

ヒトにおける結核の治療過程において、抗原血症および免疫系の状態に変化がある。

滲出液および組織の変化に関するデータは、ほとんど矛盾している。正当な理由で注目できるのは、結節性肉芽腫において、原則として、有意な数の活性化Tリンパ球が検出されることである。

ヒトにおける結核の治療における免疫学的機構の役割を理解するために必要な2つの追加の規定に留意することは理にかなっている。

• エイズ患者は、多剤耐性の特に高い発生率を有する;
• 多剤耐性（およびHIV感染の非存在下）では、免疫障害（特にT細胞リンク）が特に重要である。

結核は、広く免疫調節の様々な方法を適用すると：それは主にT細胞免疫に主に作用する薬物および単核食細胞の系である（胸腺ホルモン、イソホロン、likopid、polioksidonyら）。（弱毒化した）マイコバクテリアおよびそれらの成分を含む。

結核の分子生物学的診断

特定分析するために、特定のタイプまたは病原体株に特異的な塩基配列を有するDNAセグメント - 感染症の診断における分子生物学的方法のために含まれる、主に、方法の特定の遺伝物質を同定するために、細菌およびウイルス病原体のゲノム材料と操作に基づいて特定の医薬物質に対する病原体の感受性を決定する遺伝子中のDNA配列、および機能解析用の配列 病原体の特定の遺伝子の活性。分子生物学的手法は、1985年に開いた後、様々な細菌およびウイルス感染の診断およびモニタリングに科学的研究及び実用化に広くキャリーMyullisomた（ノーベル賞を受賞。1989）ポリメラーゼ連鎖反応。

ポリメラーゼ連鎖反応法の原理と可能性

PCRは、何百万回も数時間、インビトロでヌクレオチド配列（病原体のDNA断片）を増幅（増幅）することを可能にする。単一DNA鎖の存在下での反応は、アッセイの極めて高い感度を決定する。

DNA鎖中のある領域のヌクレオチド配列は、微生物の遺伝的同一性を決定し、PCRの高い特異性を説明する。

非常に遅い増殖を有する微生物の結核菌の生物学的特性による特性の検出および調査のために、この手法の値：培養は12~24時間である結核菌DNAの倍加時間。

PCR法の原理は増幅であり、何百万回も繰り返される。以下の3つの反応段階の循環再発の間に、チューブマイクロ体積中の特定のDNA配列の部分を掛け合わせる：各段階は異なる温度体系を通る：

• ステージI-加熱時の二本鎖DNAの鎖の発散による変性。
• II段階 - DNA断片の増殖のために選択された、厳密に特異的な鎖の末端部分を有するプライマー（プライミングオリゴヌクレオチド）の相補的結合（ハイブリダイゼーション）
• 段階III - 熱安定性DNAポリメラーゼの助けを借りてDNA断片鎖を完成させる。

インビトロでの増幅のために、マトリックスDNAの分子が存在しなければならない。アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（D）、シトシン（C）の4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ヌクレオチド）。18〜20塩基対からなる人工的に合成されたプライミングオリゴヌクレオチド（プライマー）; 68-72の至適温度を有する耐熱性DNAポリメラーゼ酵素^上の C、及びマグネシウムイオン。

PCRの特異性は、DNA断片の選択に依存する。これに従って、フランクシードオリゴヌクレオチドが合成される。ハイブリダイゼーションおよびDNA鎖の完成の特異性は、以下の対の窒素塩基：アデニン - チミン、グアニン - シトシンの相補性の原理に起因する。

結核菌ゲノムのほとんどの株に特異とともに、提供繰り返しかなりの数（10-20）、このアッセイの高い感度を有するIS6110のDNA断片を選択したほとんどの試験システム、ゲノム結核性マイコバクテリア複合最も効率的な標的増幅を決定します。同時に、少数の反復を伴う結核菌株またはIS6110断片の非存在が記載されている。

生体試料からのDNA分子の単離

PCRを実施するためには、最小量の非特異的DNAおよび酵素-DNAポリメラーゼの種々の阻害剤を用いて、最小量で生物材料から病原体のDNA分子を単離する必要がある。

試料の調製は、単離されたDNA分子による試料の交差汚染を防止する条件下で実施されるべきである。これを行うには、塩素含有溶液を使用して、紫外線、床および作業机の表面での前処理が必要です。また、清潔な手袋、使い捨て試験管、および自動ピペットの先端の義務的使用。

3から4000でサンプルを遠心分離するのに十分な臨床検体から結核菌のDNA（脳脊髄液、気管支洗浄液）その細胞、細胞破片、またはその塩の多数を含有しない、単離する。回転数を、汚泥20-30 UL 2％の溶液に加えますトリトンX-100および90で温め^について 30分間、C。

試料の粘度に応じ - 痰試料の調製のための一般的サンプルあたり50~80ミリグラムの量で、水酸化ナトリウムの4％溶液とN-アセチル-L-システイン（NALC）のために使用される効率的な液状でなければなりません。NALC溶液は、予め調製しておくか、またはNALC粉末を試料に直接加えて乾燥させることができます。液化後、試料をスクリューキャップ付きの50mlバイアル、すなわちE.E.で3.5~4,000rpm（3000g）で15分間遠心分離しなければならない 痰の前調製のために推奨されるのと同じ条件下で投与する。

ペレット方法からのDNAの抽出のために最も頻繁に微孔性粒子とDNA分子を収着酸化ケイ素（「珪藻土」）などのグアニジンイソチオシアネート溶解試薬の5~6モル溶液の使用に基づいて使用されます。次いで、DNA分子が水で脱着された後にグアニジンイソチオシアネートとエタノール溶液の2.5モル溶液で洗浄可能な阻害剤、及びこれらの試料を含む非特異的な物質は、PCRを行うために使用しました。DNA抽出の技術を単純化するために、「珪藻土」はしばしば酸化ケイ素で被覆された磁性微粒子で置き換えられる。この場合、遠心分離の代わりにマイクロチューブ用の特別な磁気スタンドを用いて粒子を沈殿させる。

ロシアでは、マイコバクテリアの免疫磁気分離によるその後の病原菌のDNA抽出の独自の方法が開発されている。結核菌に化学結合ポリクローナル（ウサギ）抗体により結合している、シリカで被覆された3~5ミクロンのferroparticlesサイズを使用して結核菌免疫磁気分離のために。アルカリ溶解後の痰の試料を酸性トリス-HCl溶液で中和し、免疫磁気吸着剤と共にインキュベートする。次に、交換可能なチップを有する磁気棒で免疫グロブリン粒子を回収し、マイクロチューブに移して沈殿させる。20〜30μlの2％Triton X-100溶液を添加し、90 ^℃で30分間加温する。上清をPCR分析のためのDNAテンプレートとして使用する。

難しい問題は、生検標本からの結核菌DNAの単離である。酵素生検では、酵素プロテイナーゼKを56 ^℃の温度で一晩200-500mg / lの最終濃度で使用する。さらに、既知の方法の1つが使用される。生検のPCR分析における過剰の非特異的DNAは、しばしばDNAの反復抽出を必要とする反応の阻害を引き起こす。

結果を検出する方法

反応の完了後、増幅された病原体のDNA断片は様々な方法によって同定される。

ゲル電気泳動法は周知である。得られたDNAフラグメントは、所望の特異的DNAフラグメントを含む陽性対照によって、またはフラグメントの既知のサイズ（ヌクレオチド対の数）に従って同定され、これは標準的な分子マーカーを用いて決定される。

特定の色素の存在下で、エチジウムブロマイドは二本鎖DNAに含まれる。合成されたDNA断片は紫外光の作用下で発光するバンドとして検出される。

電気泳動によって開始からの距離から決定されるDNAフラグメントのサイズは、既知の分子量マーカーまたは陽性対照に対応していなければならない。

ストレプトアビジン - ビオチンアルカリホスファターゼに結合することによって、例えば、酵素反応を介して検出したビオチン標識DNAプローブ、 - オリゴヌクレオチド相補有する一本鎖PCR産物のハイブリダイゼーションに基づくPCRの結果を決定する他の方法。

このタイプの検出に基づいて、酵素反応の発現後に試料中の光学密度を読み取った結果としてPCR結果の検出が自動的に行われるPCR分析装置が作成された。

これらの方法の欠点は、DNA分子のかなり短い断片による血管内汚染の可能性である。分子が新しいサンプルに入ると、それらはPCRのマトリックスとなり、偽陽性の結果につながります。

これに関して、偽陽性の結果を防ぐために、敷地の分離および分離のための厳密な規則が導入されている：生物学的サンプルからDNAを抽出すること。クリーンゾーンからの結果（電気泳動）の検出のための施設。これらの施設は汚染の可能性のあるゾーンです。別の隔離された領域は、試験すべきDNA試料をPCR用の反応混合物でチューブに導入するためのクリーンルームである。最後に、主装置であるDNA増幅器を別の、おそらくはオフィスに設置する必要があると仮定します。

前の反応の生成物の汚染を防ぐために-いくつかのLikonアンプPCRシステムテストではなく、すなわち、インビトロ合成回路内の適切な位置に代わりに組み込まれた場合、そのdezoksinukleoziduridin含むdezoksinukleozidtimidina 天然のDNAに存在するチミンの窒素塩基は、ウラシルに置き換えられる。ウラシルDNAグリコシラーゼは、分析物に反応混合物に添加されるだけ混入した断片がデオキシウリジンではなく、DNAのネイティブが分析破壊します。。その後の94 ^℃での加熱はこの酵素を不活性化し、PCRにおける増幅を妨げない。

RRNAの等温増幅に基づく試験系があり、その逆転写とDNA分子の合成が最初に行われる。これは次にRNA分子のその後の合成のためのマトリックスである。RNAアンプリコンは、反応管溶液中でハイブリダイズした場合、アクリジン染色DNAプローブを用いて検出される。この方法は、高感度に加えて、汚染を防止する1つの管で分析する利点を有する。著者らによると、呼吸サンプルにおけるこの方法の感度は、99〜100％の特異性で90％に達する。

新しい検出方法は、リアルタイムPCRで実施される。これらの方法は、PCRおよびその結果の検出が1つの閉管で同時に行われる点が主に異なる。これは分析技術を技術的に簡素化するだけでなく、以前のPCR産物による実験室および試験サンプルの汚染を防止する。

リアルタイムPCRでは、結果の検出は、蛍光発生DNAプローブとPCR中に増幅された特定のDNA断片とのハイブリダイゼーションから生じる蛍光によるものである。蛍光マーカーは、酵素反応の結果として放出のみPCR中に増幅される所望のDNA分子との特異的ハイブリダイゼーション下で消光分子蛍光から離間するように構成された構造蛍光DNAプローブ。プローブとハイブリダイズした分子数の増加に伴い、検出可能なレベルまでの蛍光の増加は、増幅産物の分子数に比例する。PCR断片のDNA分子の各サイクル数であるので、半分に蛍光を測定し、初期試料中のDNA分子の数に反比例して増加されたサイクル数を乗算されます。反応を算出することができるコンピュータプログラム及び試験材料中のゲノムDNAの量を使用して、キャリブレータとして結核菌のDNA断片を、対応する分子がいくつかの異なる既知の濃度を導入することである場合。

各標準サンプルは複製されます。定量的基準は、決定された蛍光の開始および成長に必要なPCRサイクルの最小数である。横軸 - サイクル数。縦軸は蛍光値である。DNA濃度は、蛍光の出現に必要なサイクル数に反比例する。右欄（21-32）には、対応する濃度のサイクル番号が記されています。10のDNA断片の10倍濃度の違い² -10 ⁶ 3.2-3.4サイクル- mlです。2人の患者については、IS6110断片の濃度は約10 ³ / mlおよび10 ⁴ / mlであった。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のゲノムで分析されたフラグメントの反復数（6〜20）を考慮すると、臨床サンプル中のマイコバクテリアの数は、それぞれ約100および1000細胞である。

結核の診断におけるPCRの使用

痰：臨床サンプルにおける結核菌の検出 - PCRは、結核の迅速な診断のために最も適切です。気管支肺胞洗浄液、胸膜滲出液、尿、脳脊髄液は、異なる骨溶解、女性生殖器の吸引と生検をpunctates。オランダの研究では、肺結核の確定診断で340人の患者から約500痰および気管支洗浄サンプルはPCR法、顕微鏡検査および培養研究塗抹標本の感度を比較するために検討しました。分析の感度はそれぞれ92.6.88.9および52.4％であった。すべての方法の特異性は約99％であった。

スメア顕微鏡検査、Levenstein-Jensen培地への播種、VASTES試験システムおよびPCR分析による結核菌の検出の有効性を比較した。PCRは、74.4％の感度、顕微鏡 - 33.8％、高密度培地 - 48.9％およびVASTES - 55.8％で播種した。Levenstein-Jensen培地上での播種の平均検出時間は24日間である。乳房 - 13日、PCR - 1日。

結核治療の有効性をモニターするための感度の良い迅速な方法としてPCRを使用する可能性についても議論されている。

長い時間をかけて決定された有効な化学療法を用いたPCRによって結核菌DNAの検出は、 - 1.7蛍光顕微鏡の下で定義された塗抹標本と比較ヶ月、2.5ヶ月平均で細菌検査と比較しました。

肺外結核の診断

それは、これらの臨床的およびX線撮影方法無効診断材料における結核菌の決意するための従来の細菌学的方法の下に形成するように敏感なPCR法などの値は、肺外フォームの特に大きいです。

尿サンプルの調査にPCRの結果は、活動性TB及び陰性尿4人の患者に不活性な腎結核、泌尿器系疾患nontubercular有する39人の患者と16 17の患者で陽性でした。

結核の疑いのある症例では、起源が不明な患者の骨髄吸引物の研究におけるPCR分析の有効性が実証された。結核リンパ節炎を診断するために、102例の穿刺吸引液と67例の結核リンパ節炎の疑いのある生検標本を小児で調べた。陽性の結果が得られた：71.6％のリアルタイムPCR。蛍光顕微鏡検査 - 46.3％。文化研究 - 41,8％。「ネコの傷」疾患の患者のリンパ節生検50例の研究では、すべての結果が陰性であった。したがって、PCR分析の100％特異性が実証された。同じ仕事で、リンパ節の穿刺生検で、M.アビウムの検出の可能性が実証された。

女性生殖器領域の結核の診断は、知られているように、診断の最も困難な問題の1つである。子宮内膜の生検PCRによって調べたところ、25人の患者のダグラス空間14（56％）から子宮内膜吸引液サンプルは腹腔鏡結核を疑わ調べ、陽性の結果が得られました。スメア顕微鏡法および培養を用いて、それぞれ1および2の結果が得られた。これらの症例もPCR陽性であった。ほとんどのPCR陽性の結果は、組織学的研究により結核の特徴的な徴候を有する症例に関連していた。より少ない数 - 腹腔鏡検査データによると結核の疑いがある。結核のための腹腔鏡データがない場合、PCR分析の1つの陽性結果しか得られなかった。

肺外結核症を診断する場合、臨床医は、PCR法で血液サンプルを検査する際に病原体を検出する可能性について疑問を持つことが多い。文章データによれば、血液サンプルからの結核菌からのDNAの検出は、広範な形のHIV感染で可能であることが示されている。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のDNAは、移植された腎臓および免疫抑制患者の様々な器官の一般化された結核でのみ検出された。

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マイコバクテリアの種同定

PCR法は、それらの初期成長を受信した後に結核菌群のマイコバクテリア及びマイコバクテリアnontubercularのいくつかの種の迅速な同定のために非常に有効であることができます。この場合には、PCRの使用は、その後の培養陽性同定に必要な7~10日間保存してもよいです。それは、高感度を達成するために、複雑なサンプル調製臨床材料を必要としないので、研究PCRは、技術的に非常に簡単です。この試験系の正研究80（MBヴァスト。オルガノン社）でPCRの全ての陽性培養は、厳密に特定し、1日のために開催されました。アクリジンおよびハイブリダイゼーション後の視覚的評価との化学発光またはニトロセルロースストリップを介して化学発光の出現により検出された株で標識された特異的DNAプローブとハイブリダイズ病原体培養のDNAの調製にマイコバクテリアの他の種を同定することができます。結核菌複合体：種の限られた数を特定し、そのようなキットを使用しました。M.アビウム、M.アビウムコンプレックス、カンサシイおよびM.ゴルドネー。

A.Telenti et al。また、2つの制限酵素（特性を有する酵素は、特定の点でDNA分子を切断する）でのPCR及びその後の処理によるマイコバクテリアの臨床的に重要な種の種同定の比較的単純で安価な方法を開発しました。DNA断片が増幅される。熱ショックタンパク質（65 kDaの）をコードし、次いで別々に439塩基対の2つの酵素の得られたPCR DNA断片で処理 - Bste IIとHAE III。次いで、100 1000塩基対の長さのDNA断片（分子DNAマーカー）の標準セットを使用して、それらのサイズ（塩基対の数）を決定し、二つの生成物を得、アガロースゲル電気泳動を用いて分析しました。特定の種類のそれぞれにおいて（結核菌、M。アビウム、M。イントラセルラー、M。カンサシイ、M.fortuitum）は、各制限酵素の異なるサイズの2つの又は3つのDNA断片を検出します。得られた異なるDNAサイズの組み合わせは、これらの種をそれらの間で区別することを可能にする。

生物学的DNAマイクロアレイの技術が開発されている。1つの研究で100種以上のマイコバクテリアを特定するのに役立ちます。

種識別は、対応する一次構造と比較した場合の16S rRNA可変領域のPCR増幅、続いてアンプリコン配列決定によって行うこともでき、これにより40を超える種のマイコバクテリアを同定することができる。

PCRの助けを借りて、M. BovisおよびM. Bovis BCGの分化を含む、結核菌複合体内の種同定もまた実施することができる。これを行うために、RD1のゲノム領域におけるいくつかの遺伝子の存在または非存在を分析する。RD9およびRD10。RD1は、M.bovis BCGには存在しないが、M.bovisを含む毒性種に存在する。

PCRによるMycobacterium tuberculosisの薬剤感受性の測定

結核菌の薬剤感受性または耐性についての分子遺伝学的方法の目的は、既知の遺伝子の特定のヌクレオチド配列に変異を同定するために減少させます。基本的な方法は、これらの配列の直接prochityvanii（配列決定）にPCR DNAプローブ中に増幅ビオチン標識DNA断片の増幅またはハイブリダイゼーション後のいずれかに基づいています。方法LIPA-リフ-TB - 両方の選択肢が使用するDNAプローブが酵素コンジュゲート（ストレプトアビジン - アルカリホスファターゼ）を用いてニトロセルロース膜に存在しない、または不完全なハイブリダイゼーションをもたらす配列におけるヌクレオチド置換を同定することを含みます。

ローカルmikrobiochipov法と呼ばれる抵抗性または薬物感受性の原因でPCR増幅した遺伝子領域における既知の変異に相補microsections DNAプローブに固定の蛍光を測定するための方法。この研究を実施するための主なアルゴリズムは以下の通りである。マイコバクテリアの臨床試料または培養物からDNAを単離した後リファンピシンに対する薬剤感受性を担うrpoB遺伝子の関連する断片のPCR増幅を行うことが必要であるか、またはマイコバクテリウムのタンパク質をコードするkatGおよびINHA遺伝子がイソニアジドに感受性の原因です。PCRの結果は、ここで所望の長さの適切なDNAフラグメントの受信を確認し、アガロースゲル電気泳動により評価しました。次に、2回目のPCRを行い、DNAに蛍光標識を導入する。PCRの結果は、ゲル電気泳動によって再び確認される。その後、ハイブリダイゼーションは、小さなガラス板短いDNA鎖の可能な変異の点で薬剤感受性型結核菌のヌクレオチド配列に相補的である（プローブ）に固定された多数のであるバイオチップ上に得られた物質を洗浄し、（一晩インキュベーション）を行いました。ならびに薬物耐性の原因となる突然変異体配列に関連する。プレート上のDNAプローブの位置 - 厳密に定義され、特別な読み取り装置を使用して結果を決定するためのハイブリダイゼーションの際に観察された蛍光のレベルがインストールされています。この点に関して、分析の結果は、特別なコンピュータプログラムによって決定される。

近年、リアルタイムPCR技術に基づいて、マイコバクテリアの結核の薬剤感受性を決定するための別の方法が開発され、クローズドチューブ試験でこれらの研究を行うことが可能になっている。

図2 図13-13は、リアルタイムPCRによるリファンピシンに対する薬物耐性の決定におけるマイコバクテリウム・ツベルクローシスの臨床培養の分析の結果を示す：218 - コントロールサンプル（リファンピシンに感受性）; 93 - Ser-Trp TCG-TGGの変異の陽性対照; 4482 - Ser-Leu TCG-TTGの突然変異の陽性対照; 162-322 - 実験サンプル。4チャンネルにおける増幅の動力学曲線の計算結果：チャンネル1：Ser-Trp TCG-TGGの突然変異のための393陽性対照; チャネル2：4482 - Ser-Leu TCG-TTGの突然変異の陽性対照; 162,163,172,295-実験サンプル; チャネル4：実験に参加しているすべてのサンプルの増幅の動力学的曲線。増幅反応のポジティブコントロール。結論：分析の結果に基づいて、リファンピシンに対する耐性を決定する以下の突然変異が明らかにされた：試料162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG。同じ原則が、最も頻度の高い突然変異を決定する遺伝子katGおよびinhAのイソニアジドに対する薬剤耐性を決定するために用いられた。

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マイコバクテリウム・ツベルクローシスの菌株同定

結核菌の菌株の同定の最も徹底的に研究方法は、結核菌のDNA酵素のPvu IIのfragmentirovanin（制限）に基づいており、フラグメントがDNAである特定の配列とそれに続くハイブリダイゼーションが得られる技術と呼ばれる制限断片長多型（RFLPのRFLP、または英語版で）でありその繰り返し要素IS6110。IS6110の繰り返し数とDNA上の位置が異なるため、種間の変動性が実現します。特定の酵素制限酵素攻撃点（制限部位）とIS6110要素との間の様々な距離が含まれる。この技術は非常に複雑で時間がかかります。結核菌の培養物から抽出したDNAで処理した後、ゲル電気泳動、制限酵素を用いて行われ、次いで、ニトロセルロース膜上に、異なる長さのDNA断片を移し、ハイブリダイゼーションは、IS6110エレメントのフラグメントを用いて実施し、酵素反応により検出しました。得られたバンドの特異的パターンは、結核菌の特定の株のDNAを特徴付ける。コンピュータ分析の助けを借りて、菌株の同一性または関連性が明らかになる。RFLP法が最も差別的であるという事実にもかかわらず、すなわち、分析された菌株の最大の差異を明らかにするが、いくつかの菌株で観察される少数（5未満）のIS6110反復では効果がない。図2 図13-14は、株のRFLPタイピングの結果を示す。

代替方法は、スペーサーDNA配列の多型の分析である、スプライトタイピングの方法であり、DR領域の直接反復の中間であり得る。株のスポロ型分析を実施する場合、DR領域を制限するプライマーを用いてPCRを行い、その後、可変長のDNAの中間領域とハイブリダイズする異なる長さの断片が形成される。DR領域のスペーサー配列の分析が提示される。研究者によれば、より単純で生産的で、菌株の一次スクリーニングおよび予備的疫学分析に適しており、直接臨床材料を研究している。

明らかに、より有効かつ技術的にアクセス可能な方法は、VNTR（英単語の略語）、または結核菌のDNA中の正確なタンデムリピートの可変数を決定する方法である。この方法はPCRの使用にのみ基づいており、追加の操作を必要としません。異なる株および異なる遺伝子座におけるタンデムリピートの数が異なるので、異なるサイズのフラグメントが決定され、PCR産物の得られた電気泳動で分析される。研究者によれば、VNTRを使用すると、RFLP法よりもより大きなひずみの識別が達成される。

近年、W-北京家系（時には北京株と呼ばれる）のマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）株の分布に多くの注意が払われており、これらは主に薬剤耐性である。

分子生物学的研究の質に対する基本的要件

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PCRのための基本的な規制文書

病原性の生物学的に感染したPCR材料を用いた研究では、作業の1.3.1888-04「組織：2000年7月2日のグラムから№45... 2003年3月21日のグラムから数109 .. 2000年2月21日から64番、ガイドライン：受注保健のロシア省病原性のIII〜IV群の薬剤」; 1.3.1794-03「I-II病原性グループの微生物に感染したPCR材料の研究における研究の組織」。2003; 3.5.5.1034-01「物質の除染、感染細菌I-IVの病原性基PCR、使用」2001同定、診断および結核の治療における微生物学的検査法のための統一された説明書の付録11。

[76], [77], [78]

スタッフ

分子生物学的研究の実行、臨床検査診断、医師の細菌学者、ウイルス学者、医師、生物学者、臨床診断検査室だけでなく、二次医療教育と専門家の医師を保持することができるが、所定の方法で専門と高度な訓練を通過しました。

研究所施設の整備

次のラボラトリールームが必要です：

• サンプル取扱いエリアは、Methodical Instructions 13.1888-04に従って、III-IV病原性グループの感染性病原体で働くように適合された実験室である。
• 反応混合物を調製するためのゾーンPCR-内部の実験室汚染から保護する「クリーン」ゾーン。
• PCR産物を分析するために電気泳動またはハイブリダイゼーションを使用する場合。乗算DNA断片をチューブおよび増幅から抽出された実験室は、それぞれ、PCRの実験室の要件に応じて、環境へ（1.3.1794-03ガイドライン、ガイダンス1.3.1888-04）を得ることができ、完全でなければなりません前のパラグラフに示されている施設から隔離されています。試料の取り扱い及び任意の人員、機器、任意の材料およびオブジェクトの「きれいな」領域のための電気泳動、ならびに換気システムを通る空気の移動、またはドラフトの結果をゾーンへの移動ゾーンから除外すべきです。このゾーンは、PCR産物の蛍光検出には必要ありません。
• 結果の文書化と処理のための部屋には、コンピュータと必要な事務機器が備わっています。この部屋には、チューブを開かずにPCR産物の検出を提供する装置が含まれている場合があります。リアルタイムPCRのための蛍光PCR検出器およびサーマルサイクラー。

痰の一次治療のための衛生的および疫学的要件は、マイコバクテリアの結核を扱うための標準的な微生物学的要件と同様である。

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PCR診断のための実験装置の完成

研究室には、次の部屋の設備が含まれています。

• 試料調製のための部屋で、以下の機器を含む：II級防護層「SP-1.2」：「エッペンドルフ」タイプの試験管のための加熱カバー付きの固体状態サーモスタット; 13,000rpmでの微量遠心分離機; 遠心分離機（ボルテックス）。-20の温度範囲を有する冷蔵庫^の C 10 ^〜約 C。可変量の「ローリン」シリーズのピペット; OM-1トラップフラスコを備えたポンプ; ピペットの三脚; 三脚ワークステーション200x0.5 ml; 三脚ワークステーション50x1.5 ml; 試験管を保管するためのスタンド80x1.5 ml;
• 反応混合物調製室：保護チャンバーPCR-box（「Laminar-C。遠心分離 - ボルテックス; Prolineシリーズの可変容積ピペット; ピペットの三脚; 三脚ワークステーション200x0.2 ml; 試験管を保管するためのスタンド80x1.5 ml; -20の温度範囲を有する冷蔵庫^の C + 10まで^の C。
• 電気泳動用の部屋：水平電気泳動のためのカメラ; 電源; トランスイルミネーター;
• コンピュータおよびソフトウェアを用いたDNA増幅装置または核酸分析装置（リアルタイムPCR）; すべての予備の部屋に置くことができます。リアルタイムPCR技術が使用される場合。電気泳動のための部屋は必要ない。

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外部品質管理

客観的に信頼できる結果を得るためには、研究所は研究室の質の外部評価システムに参加すべきである。

品質管理システムの参加者には、大腸菌E.コイアを含むそのうちの2つは凍結乾燥された細菌細胞懸濁液の12個のバイアル、10で結核菌（非病原性株）で3つのバイアル² / mlで 10 ⁴ / mlの濃度の類似株の細胞を含む3アンプル; 非結核菌マイコバクテリアM. Avium-intracellulareおよびM. Kansasiiの2アンプルを10 ⁵ / mlの濃度で含む。

外部の品質評価のための分散テストは、この分野で豊富な経験を有する2つの独立したラボで事前テストされています。

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