臍帯血の造血幹細胞

臍帯血は、造血細胞の増殖能および再増殖能力に対する造血幹細胞の供給源として作用する。送達の時点で、臍帯血は十分に多数の造血前駆細胞を十分に多数含むことが繰り返し示されている。一部の著者は、臍帯血の造血幹細胞移植の利点は、HLA抗原のための互換性のあるドナーを見つけるために必要ではないと信じています。それらによると、新生児の免疫システムの原因の未熟さは、骨髄移植に比べて低く、それに応じて、厳しい反応「移植片対宿主」の発生率を免疫担当細胞の機能活性を低下させます。臍帯血のこの細胞移植生存にも患者の体重1kgあたり投与GSKの少ない数を用いた場合に、骨髄細胞よりも低くありません。しかし、我々の見解では、受信者の体内で効率的に移植するために必要な臍帯血細胞を移植された質問の最適な数は、その免疫学的互換性、および臍帯血の造血幹細胞の移植の他の側面の数は、より深刻な分析が必要です。

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臍帯血の造血幹細胞の取得

胎盤が子宮や子宮外では、だけでなく、帝王切開のためですが、また、子宮外時に臍帯血の造血幹細胞を得るための手順は、すぐに誕生し、胎盤からの分離後にその摂取が必要です。臍帯血の体積が25〜40ミリリットルの平均によって増加し得る胎盤分離によって新生児を出産からの時間を短縮する場合には最大30秒ことが示されています。後の手順では、同じ量の血液が失われます。アフターバーンからの子供の早期離婚は新生児に否定的な影響を与えないことが確立されている。

血液のロシアの研究所と輸血は、臍帯生理系統（（+ 25.8 70.2）ミリリットル）の血液と帝王切開（（+ 25.1 73.4）ml）の両方のための効果的かつ低コストの技術を開発しました。それぞれ、（83.1 + 9.6）と（83.4 + 14.1）％、 - 単核球及び有核十分に高い収率で臍帯血を分離するための方法。それぞれ（96,8 + 5,7）および（89.6 + 22.6）％、 - 高い核細胞およびCFU-GMの安全性を保証する臍帯血の凍結保存のための改良された方法。容器を用いて排水臍帯血サンプリング法の効率「Kompoplast-300」（ロシア）。フェンス臍帯血の作者は、子宮や子宮外で胎盤を配置するという点で、出産や胎盤からの分離直後に行きました。70％のエチルアルコール - 1回2回、次いで5％のヨードチンキ、とで処理された臍帯静脈臍帯の穿刺前に。血液は接続管を通って容器に自発的に流れ込んだ。フェンスの所要時間は10分を超えなかった。66個の収集排水体積法臍帯血サンプルは、（72 + 28）mlの平均、および試料中の白血球の数は、全平均 - （1.1 + 0.6）X X 107無菌ための臍帯血（細菌汚染の分析、出生胎児面を下向き特別なフレーム上に配置した後にのみつのサンプル中のB型およびC型肝炎、梅毒、およびサイトメガロウイルス感染）のHIV-1ウイルスは胎盤一旦別の研究ではC型肝炎へのIgG抗体を同定し、コードを5％水酸化ナトリウムで処理しました。ヨウ素および75％のエチル 目のアルコール。輸血システム（G16）から針を用いて臍帯の静脈を排液した。血液は容器内に自発的に流出した。このようにして採取した血液量は、平均（55 + 25）mlであった。紙G. Koglerら（1996）臍帯血は、閉じた方法を採取し、血液を大量に取得 - 平均（79 + 26）mlの上。著者は、574臍帯血サンプル間の移植のためにそれらを使用することはできません血液の40ミリリットル、より約7％以下を含有していることに注意してください。K.磯山ら（1996）は、シリンジを用いたアクティブexfusionによって臍帯血を取って、血液の69.1ミリリットル（15〜135 mlの変化臍帯血量）の平均を受けました。最後に、punovinnoy静脈カテーテルによるA.アブデル - Mageed PIの共同研究者（1997）は、臍帯血（56から143ミリリットル）の平均94ミリリットルで得られました。

62.5 mlを含む、広く使用されているtransfuzioinoyシステムバクスター・ヘルスケア社、ディアフィールド、イリノイ州（米国）に基づいて、クローズドシステムの血液収集を開発母体分泌による医原性感染及び汚染の危険性を減らすためにCPDA（アデニンとクエン酸 - リン酸 - デキストロース）のような抗凝固剤。材料を製造するための技術は、細胞懸濁液の含有量及び純度の量に品質サンプルの相対的な調製のために最も重要です。閉鎖系で有意材料の微生物汚染のリスク、ならびに母細胞の細胞懸濁液の汚染を減少させるように臍帯血回収の既存の方法のうち、第1の閉、セミオープンとオープンシステムsleduetotdavat嗜好に分類kotoryeuslovno。

Naglerおよび共同研究者（1998）は、3つの臍帯血サンプリングシステムのすべての有効性の比較分析を行った。第1の変形では、手順は、容器への血液の直接的な排出によって閉鎖系で実施された。第2の変法では、臍帯静脈をさらに洗浄し、同時に血液を容器に排出する（開放方法）、シリンジ1の能動的な血液滲出の方法によって臍帯血を得た。第3の変形例では、注射器で積極的に抽出し、臍帯動脈を洗浄して容器内に同時に流し込むことにより、半開きシステムで血液を採取した。最初のバージョンでは、臍帯血（76.4 + 32.1）ml、白血球数（10.5 + 3.6）x 1 ⁶、血液1ml当たり臍帯血を受けた。第2の変法では、対応する指数は（174.4 + 42.8）mlおよび（8.8 + 3.4）×10 ⁶ / mlであり; （173.7 + 41.3）mlおよび（9.3 + 3.8）x10 ⁶ / mlでは、開放系を用いた場合、臍帯血試料の感染が最も頻繁に認められた。胎盤の質量と抽出された血液の量との間の直接的な相関関係が確立され、胎盤の質量が増加すると、採取される血液の量が増加する。

臍帯血の採取後、分離工程は単核細胞の単離および赤血球からの細胞懸濁液の精製に続く。実験条件下で、有核細胞は、塩化アンモニウムによる赤血球の溶解中にメチルセルロースを用いて沈降させる方法によって単離される。しかし、臨床目的では、造血幹細胞の損失が50〜90％に達するので、メチルセルロースを使用すべきではない。診療所での作業溶液を大量に関連して赤血球を溶解してもほとんどの有核CD34 +の表現型を有する細胞、および前駆細胞CFU-GM機能およびCFU-GEMMがかなり高い。このように分離の割合が、行いません。密度勾配バイヤント密度溶液（BDS72）における単核細胞の単離のための新しい薬剤が報告されている。この物質は、以下の生理学的パラメーターを有する：pH7.4、浸透圧280mosm / kg、密度1.0720g / ml。著者らによると、その助けにより、CD34陽性細胞を100％まで単離し、赤血球を98％除去することが可能である。ただし、BDS72はまだ適用されていません。

臍帯血から有核細胞を試験した分離方法は、典型的には10％HES溶液または3％ゼラチン溶液を用いています。両方の場合における赤血球の沈殿および有核細胞の単離の効率はほぼ等しい。しかしながら、可能な沈降剤ゼラチンとして使用する場合にHESを使用する場合よりもCFU-GMの幾分大きな数を得ることができます。このように造血細胞表面の受容体に吸収された個々の画分または有核細胞能力HES分子の堆積による回収効率CFU-GM不等速度差とは、in vitroでのCFU-GMを培養する際に使用される因子、コロニー刺激に対する感受性を遮断することを想定しています。それにもかかわらず、両方のsedimenterはよく大規模臍帯血バンクの作成中の有核細胞の単離のために適切であり得ます。

原則として、臍帯血の分離および凍結保存の方法は、成人ドナーの末梢血および骨髄の造血幹細胞を用いた研究で使用されたものと異ならない。しかし、多くの臍帯血サンプルをその銀行のために準備する場合、分離の方法は、まず低コストでなければならない。従って、残念なことに、残念なことに、臨床的必要性がすでに臍帯血細胞の単離および凍結保存の通常の方法が用いられており、より効果的で経済的に有効な方法が多くの実験者に残っている。

総合的な評価基準は、感染性病原体を検出するために、自分自身の造血細胞数の要件と臍帯血サンプルの調査にを設立しました。造血臍帯血細胞の移植を確実にするためには、すべての血液検体を、主として血液系感染症および遺伝病について検査しなければならない。一部の著者は、ブルトン、病気Harleraとパンター無ガンマグロブリン血症サラセミアと鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、遺伝疾患の診断を目的とした臍帯血の研究の追加の特別な方法をお勧めします。

お薦めTicheli L.ら（1998）によれば、臍帯血の各試料中の有核細胞、SB34陽性細胞およびCFU-GMの数を決定することが必要である、血液型ABOおよびRhをそのメンバーシップを決定するために、HLAタイピングを運びます。また、播種は、HBs抗原、C型肝炎、HTLY-IおよびHTLV-II（T細胞白血病、ヒト）、梅毒、トキソプラズマ症がHIVおよびCMV感染の細菌、血清学的検査を実施します。サイトメガロウイルスおよびHIV感染に対するポリメラーゼ連鎖反応は必須である。

臍帯血を採取するための手順は、医学的生命倫理の原則に厳密に従って行うべきである。採血開始前に、妊婦の同意を得る必要があります。輸血から文書の完成までのすべての操作を行うインフォームドコンセントを取得するための妊婦への予備インタビューは、医療関係者のみが行う。いずれの場合においても生命倫理と人権の確立された規範の違反の観点から、生物学、化学、製薬および他の非医療教育を受けた人員によって、これらの手順のいずれかを実行する許容できません。キャリアのHBsAgについて陽性の試験のために、C型肝炎の原因物質に対する抗体は、HIV及び梅毒臍帯血を採取しない、および採取した血液サンプルが既に廃棄され、破壊されます。新生児における潜伏感染のキャリッジしたがって血行転送及び臍帯血細胞の造血注入の感染性合併症の発症の確率は、成人ドナーからの骨髄の移植の場合よりも著しく低い、成人におけるよりもはるかに稀であることに留意すべきです。

診療所における臍帯血の適用における重要な点は、臍帯血試料中の造血幹細胞の数および移植に必要な細胞用量の決定に基づく、移植の評価である。移植に必要な最適な臍帯血細胞数の基準はまだ開発されていない。CD34陽性細胞およびCFU-GMの数のような日常的なパラメータでさえ、一般に認められている視点はない。いくつかの著者は、顆粒球、赤血球、単球および巨核球に共通のコロニー形成単位であるCFU-GEMMの濃度を決定することによって、長期培養を分析することによって、造血細胞の可能性を評価する。

しかし、臨床現場では、臍帯血移植の標準評価は、通常、有核または単核細胞の数の決定のみを含む。

臍帯血の造血幹細胞の保存

造血臍帯血細胞を保存する技術にはいくつかの問題がある。場合、それらの最適な凍結モードを達成するために、造血幹細胞の凍結保存は、臍帯血、以前溶血赤血球抗原（ABO、RH）の非互換性の反応のリスクを回避するために除去赤血球の量を最小にしなければなりません。これらの目的のために、有核細胞を単離するための様々な方法が適している。1.077グラム/ mlの密度、または密度1.080グラム/ mlのパーコレーションとフィコールに基づいて、密度勾配中の有核細胞を分離するの最も広く使用されている方法、前世紀の90年代初頭に。密度勾配によって分離臍帯血は、主に単核細胞を選択することを可能にするが、造血前駆細胞のかなりの損失につながる - 30〜50％までです。

臍帯血細胞の単離過程におけるヒドロキシエチルデンプンの沈降効率は、異なる方法で推定される。いくつかの著者は、この方法を用いて分離の質が低いことを示しているが、他の研究者は、すべての可能な方法の中で、ヒドロキシエチルデンプンの6％溶液を用いてHSC臍帯血を正確に割り当てることを好む。これは、いくつかのデータによれば、84％から90％に達する造血細胞の高い沈降効率を強調する。

赤血球、白血球および血漿リング：別の観点のサポーターは、ほとんどすべての分別プロセスが大きな損失yadrosoderzhashih細胞が関与して、遠心分離3画分に臍帯血を分離することによって分離を行うために提供していると思います。このようにして細胞を分離し、本発明者らは、CD34 +免疫と初期造血前駆細胞と細胞の単核細胞の含有量は、最終的にそれぞれ90、88および元のレベルの100％であったことを発見しました。他の研究者によって得られた臍帯血細胞のこの方法で精製された成長の同様の量：沈降が92％、98％割り当て有核後 - 単核、96％ - CD34陽性細胞およびコロニー形成単位106％に。

1990年代後半にはゼラチンが沈降剤として広く使用されていました。臨床診療では、1994年から臍帯血から単離されたゼラチン造血幹細胞を用いました。ゼラチンの3％溶液を使用する場合、有核細胞の単離効率は88〜94％に達する。臍帯血バンクを作成中のゼラチンの普及は、堆積物の他の手段を介してその利点を確認しています。試験臍帯血試料の各々におけるそれらの逐次的使用の観点から有核細胞の単離上記の方法の全ての比較分析は、CD34 + / CD45 +、ならびにCFU-GMおよびCFU-GEMMの数によって表現型を有する最適sedimenterアウト単核細胞を3％であることを示しましたゼラチン溶液。これは、有意に少ない効果的なフィコール密度勾配を用いる方法、および造血細胞の損失は60％に達しているメチルセルロース及びヒドロキシエチルデンプンの使用であることが判明しました。

臍帯血の幹細胞移植容積の拡大は、その製造方法の開発だけでなく、貯蔵にも関連する。長期貯蔵のための臍帯血の調製およびその試料のための最適凍結保存技術の選択に直接関連する多くの問題がある。それらの中には、分離手順の実行の便宜性、様々な低温保存媒体の使用、および移植のための解凍細胞の調製方法の使用の問題がある。臍帯血の天然試料の輸送は、血液学的中心から離れた領域から実施されることが多い。これに関連して、受精の瞬間から凍結保存の開始までの臍帯血の貯蔵のための許容期間の問題が生じ、これは臍帯血バンクの開発において特に重要である。

液体窒素中で造血臍帯血細胞の機能的活性の研究（12歳まで）長期保存後は、この期間中の造血細胞の約95％が彼らの高い増殖能力を失わないことを明らかにしました。紙Yurasova S.ら（1997）は、24と48時間室温（22℃）で、または4℃で保存その臍帯血は、実質的に最初のレベルは、適切92である造血細胞の生存率を低下させない立証しました88％であった。しかし、貯蔵時間を3日に延長すると、臍帯血中の生存可能な有核細胞の数が有意に減少する。同時に、他の研究では、22℃または4℃の温度で2~3日間保存中に主に造血細胞を成熟顆粒球の生存率に影響を与えるではなく、ことを見出しました。

造血幹細胞の臍帯血の生存率は、採取のためのシステム成分によって悪影響を受ける可能性がある。作用機序は、24〜72時間の臍帯血保存条件における造血前駆細胞のためのカルシウムイオン（ACD、EDTA、XAPD-1）の結合に起因する異なる抗凝固剤の効果の分析は、有核細胞の生存能力に対するそれらの負の影響を明らかにしました。これに関連して、著者らは、彼らの意見では、それが可能な72時間貯蔵未分画臍帯血までの持続時間を増加させることができるし、コロニー形成単位の機能的活性を保存し、20 U / mlの濃度で保存剤なしのネイティブヘパリンを添加したPBS（リン酸緩衝液）を使用することをお勧めします。しかし、CFU-GMおよびCFU-Gの安全性を検討すると、凍結保存前の臍帯血貯留時間は9時間を超えてはならないことが示されている。もちろん、この場合には矛盾するデータがある場合、最小推奨臍帯血保管寿命を使用し、可能な限り迅速にプログラム可能な凍結単離された細胞を開始すべきであるという原則を行動しなければなりません。

臍帯血の造血幹細胞を凍結する場合、DMSOの10％溶液が通常凍結保護剤として使用される。しかし、発現された凍結保護効果に加えて、この濃度のジメチルスルホキシドは、臍帯血の血液形成細胞への最小限の曝露の条件下でさえ、直接的な細胞毒性効果を有する。DMSOの細胞毒性効果を低下させるために、曝露温度ゼロ、全ての操作の速度の増加、および臍帯試料の解凍後の繰り返し洗浄が適用される。

ウクライナの医学アカデミーの血液学および輸血研究所は、幹細胞の代替源として臍帯血を研究することを目的とした1995年以来、科学的方向性を開発してきました。特に、未分画および分画した臍帯血の造血細胞の低温凍結保存のための新しい技術が開発されている。低温保護剤として、低分子量の医学ポリビニルピロリドンが使用される。未分画臍帯血の低温保存法は、凍結のための細胞の前処理技術と、移植直前の細胞懸濁液の特殊処理技術に基づいています。

凍結保存された造血幹細胞の機能活性のレベルに影響を及ぼす最も重要な因子の1つは、特に晶出期の細胞懸濁液の冷却速度である。凍結の速度および時間の問題を解決するためのソフトウェアアプローチは、移植前に凍結保護物質から細胞懸濁液を洗浄することなく、単純で非常に効果的な凍結保存方法を作成する大きな機会を提供する。

即時凍結および解凍の段階は、調製中の細胞の生存能力にとって最も危険である。造血細胞を凍結すると、それらのかなりの部分が、細胞間培地の液体から固相結晶化への移行の瞬間に破壊され得る。細胞死のパーセンテージを減少させるために、凍結保護剤が使用され、その作用メカニズムおよび凍結保護効果は科学文献で十分にカバーされている。

骨髄および臍帯血細胞の凍結保存の有望な方向の最適化技術、細胞内DMSOのレベルおよび細胞外包囲効果を有するヒドロキシエチルデンプンまたはアルブミンに作用する、例えば、作用のいくつかの異なる機構を凍結防止剤の低濃度に同一の溶液中で組み合わせることです。

臍帯血細胞の凍結保存のために伝統的に、氷浴中で永続的に機械的に攪拌され、20％DMSO溶液を使用している、ゆっくりと（1：1）に等しい達成するために、細胞懸濁液に注ぎ、細胞懸濁液と凍結防止剤の体積比。ジメチルスルホキシドの最終濃度は10％である。次いで、細胞懸濁液を、HS /分の速度で-40℃までのソフトウェアクライオスタットで冷却し、その後冷却速度を10℃/分に上昇させる。-100℃に達した後、細胞懸濁液を入れた容器を液体窒素（-196℃）に入れる。凍結保存のこの方法により、解凍後の機能的に活性な単核細胞の安全性は初期レベルの85％に達する。

凍結保存法の改変は、ヒドロキシエチルデンプンを添加することによってDMSOの濃度を低下させることを目的としている（ジメチルスルホキシドおよびヒドロキシエチルデンプンの最終濃度はそれぞれ5％および6％である）。この凍結保護剤の組み合わせの高い効率は、骨髄系細胞の懸濁液が凍結され、ジメチルスルホキシドの単一の10％溶液よりも少ない細胞防御で観察される。生存可能な有核細胞の数はベースラインレベルの96.7％に達し、CFU-GMの数で見積もられたそれらの機能活性は81.8％であった。

5から4％のヒドロキシエチルデンプン（最終濃度）と組み合わせた10％の範囲の濃度でジメチルスルホキシド溶液を使用する場合、これらの範囲内のCD34陽性細胞の保存が実際に不変のジメチルスルホキシドことを見出しました。5から2.5％までのDMSO濃度を低下させる条件で同時に臍帯血細胞の大量死が観察された - 生細胞単位の数は85.4 12.2％まで減少します。他の著者らはまた、（著作権の実施形態では - 自己血清と組み合わせて）、ジメチルスルホキシドの5及び10％溶液であったと結論付け、最大効率で臍帯血HSCの凍結保存中に細胞保護を提供します。加えて、高い安全性を順次凍結および解凍細胞は、特に、TOS /分の制御された冷却速度で5または10％DMSO、4％のヒドロキシエチルデンプン溶液の組み合わせの場合にマークされます。等しい体積比（最終DMSO濃度は5％であった）までの細胞懸濁液に添加し、5：4：DMSO、1の割合で精製ヒトアルブミンおよびRPMI培地 - 別の論文では既に3つの成分からなる凍結保護溶液を使用します。+ 4℃の水浴中で解凍した後、CFU-GMの安全性は94％を超えた。

一部の著者は、赤血球の除去中に有意な量の造血細胞が失われるため、凍結保存のために未分画の臍帯血を使用することを提案している。この実施形態では、ジメチルスルホキシドの10％溶液を用いて、単核細胞を低結晶化の損傷効果から保護する。凍結は、HS /分〜-80℃の一定の冷却速度で実施し、その後、臍帯血細胞の懸濁液を液体窒素中に浸漬する。この凍結方法では、赤血球の部分的な溶解が起こり、したがって血液試料は分画を必要としない。解凍後、細胞懸濁液を、ヒトアルブミンの溶液中または遊離ヘモグロビンおよびジメチルスルホキシドから、または患者の自己血清中で洗浄し、移植に使用する。

未分画臍帯血を解凍後の造血前駆細胞の保存を分画しより確かに高いが、赤血球のkrioustoychivostyuに関連して、ABO不適合性赤血球の輸血後輸血の結果として深刻な問題を引き起こす可能性があります。さらに、保存された未分画血液の体積は著しく増加する。臨床的な観点から、さらに好ましくは凍結保存は、以前に単離し、臍帯血造血細胞の他の細胞画分から精製しました。

特に、この方法は、臍帯血細胞の凍結保存である組成plazmozameshchath溶液中のヒドロキシエチルデンプンの6％溶液「Stabizol」を使用した、凍結に備えて赤血球を除去できるように分画しました。解凍後、このようにして得られた細胞懸濁液は、追加の操作なしで臨床使用のための準備が整う。

従って、現在のところ、臍帯血の凍結保存の多くの非常に効果的な方法が存在する。主な違いは、血液試料が未分画で凍結されているか、または調製段階で細胞画分に分離され、赤血球の混入なしに有核細胞を採取することである。

臍帯血の造血幹細胞の移植

80年代後半 - 90年代初期の妊娠中に胎児に供給される臍帯血は、造血幹細胞の含有量が高いことが特徴であることが判明した。臍帯血細胞を得ることが比較的容易であり、明白な倫理的問題がないことから、実用的な医学における臍帯血幹細胞の使用が促進された。Fanconi貧血を有する小児への臍帯血の最初の成功した移植は、臍帯血幹細胞移植の量を拡大し、その銀行供給のためのシステムを創出する出発点として役立った。臍帯血バンクの世界的なシステムでは、最大のものがニューヨーク国立胎盤血液センターであり、これは国立衛生研究所のバランスシートにあります。この銀行に保管されている臍帯血サンプルの数は、20 LLCに近づいています。レシピエント（主に子供）の数も増えており、成功した移植が行われています。米国保健省によると、HSC臍帯血のレシピエントの移植後の生存期間はすでに10年を超えています。

臍帯血の造血ポテンシャルの多くの研究は、最も初期の幹細胞の量と質だけでなく、成人の骨髄に劣っていないことが示されているが、いくつかの対策がそれをも超えたことで、これは驚くべきことではありません。臍帯血の幹細胞の高い増殖能力は、特定の成長因子へのHSC上の受容体の存在は、臍帯血細胞の能力は、成長因子、大きなサイズおよびテロメアの長さの生産を自己分泌する発達細胞シグナル伝達機能を引き起こしました。

したがって、幹血液形成臍帯血細胞のゲノムおよび表現型の特徴は、レシピエント生物におけるドナーの造血の回復の可能性が高い移植の定性的な移植を事前に決定する。

臍帯血の造血幹細胞の利点

全身麻酔の必要性を排除しながら、造血細胞の他のソースの上に移植のための造血臍帯血の幹細胞を使用しての本当の利点の中には、（例えば胎盤と見なされていない場合）、ドナーの健康にほぼゼロリスクに留意する必要があります。臍帯血細胞移植の使用は、HLA適合性グラフトシステム（1〜3個の抗原から非互換性）によって部分的に膨張します。稀なHLA型を得る確率が高く、検索時間HLAがマッチした同種移植を低減凍結状態、造血臍帯血細胞の長期保存技術。同時に、伝送ルートによって送信される潜在的な感染症を発症するリスクが大幅に低減されます。さらに、自己移植のために臍帯血細胞を使用する可能性に関連して、安価な形態の生物学的生命保険が存在する。

しかし、臍帯血由来の試料の細菌汚染の最小リスクの条件に厳密に準拠して臍帯静脈から血液の最大可能量を求める問題前面に胎盤（これ以上100以下ミリリットルの平均）から収集することができる血液の少量からです。

臍帯血から原始造血細胞は、一般的に、インビトロでクローン原性アッセイまたはコロニー形成を調べることによって、その表面glikofosfoproteinaのCD34に、およびそれらの機能的特性に基づいて存在によって同定されます。80と25％、CD34 +の合計クローニング効率 - 比較分析は、臍帯血および骨髄フラクションにおけるCD34陽性単核細胞の最大含有量は、それぞれ1.6および5.0％CD34 +細胞の亜集団におけるコロニー形成単位の最大レベルであることを示しましたβ細胞 - 88と58％、高増殖能（-populyatsii CD34 +の中にHPP-CFC）で最大コロニー形成細胞 - 50および6.5％。これは、CD34 + CD38 - 細胞および臍帯血の造血幹細胞においても高いサイトカイン刺激に応答する能力のクローニング効率ことを追加する必要があります。

組み合わせ表現型抗原のThy-1、CD34およびCD45RAは、臍帯血造血細胞の高い増殖能力を確認し、臍帯血細胞の表面上の3つの抗原の発現は、それらが幹細胞に属していることを示しています。さらに、臍帯血は、線形分化マーカーを有さないCD34 +表現型を有する細胞を含むことが確立されている。CD34 + / Linの表現型プロファイルを有する細胞亜集団の臍帯血におけるレベルは、CD34陽性細胞の総数の約1％である。造血臍帯血前駆細胞は、リンパ系細胞株および多能性骨髄系統の線状細胞分化の両方を生じさせ、これもそれらが幹細胞に属することを示す。

既に述べたように、骨髄と臍帯血との本質的な違いは、移植に使用される造血細胞の量であり、これは1つの手順で得られる。分離プロセスにおける細胞塊の骨髄移植の損失、凍結保存、融解およびテストは40〜50％の範囲内で許容される場合、臍帯血細胞、このような損失は、HSC移植の不十分な数を使用するときに理不尽であってもよいので、非常に重要です。10キロ電位移植（採取した臍帯血サンプルの総数 - 2098）のレシピエント体重における細胞移植のためのG. Koglerら（1998）によれば、 - 67％、およびのみすべての臍帯血サンプルを、体重35キロであってもよいですサンプルの25％は50〜70kgの体重の患者に効果的な移植を提供することができる。この臨床状況は、臍帯血細胞のサンプリング、複製および保存の既存の方法の有効性を最適化および改善する必要性を示している。そのため、サンプリング方法、試験、分離および臍帯血の凍結保存の標準化の問題は、現在広く血液銀行、クリニックでの使用の作成、などの条件や臍帯血の造血幹細胞の保存の条件を確立するために文献で議論されています。

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医薬品における臍帯血の造血幹細胞の利用

通常、10 ^6までの造血幹細胞は臍帯血から単離することが可能で、ごくまれにしかできません。これと関連して、今日まで、成人レシピエントの造血を回復させるためには、非常に多くの造血臍帯血細胞が十分に満たされているのか疑問である。この問題に関する意見は分かれた。一部の研究者は、この量は、移植の子供たちのために十分な、しかし政権は10×（7-10）最適であるため移植成人に小さすぎると信じ⁶体重1キロあたりのCD34陽性細胞- 7×10の平均⁸移植当たり。これらの計算から、1つの臍帯血サンプルは成人患者への1回の移植に必要とされる造血幹細胞よりも700倍少ない造血幹細胞を含むことになる。しかし、このような定量的評価は、骨髄における輸血細胞の数との類推によって行われ、造血の発生原性の特徴を完全に無視する。

骨髄の造血前駆細胞と比較して、特に、それが実際に臍帯血の造血幹細胞の高い増殖能力を無視します。試験管内コロニー形成ポテンシャルの調査結果は、1回投与量は、成人受信者の臍帯血造血再構成を提供できることを示唆しています。臍帯血中のCD34陽性細胞の内容を直線的に妊娠40週まで（妊娠の早期終了の場合に得られた研究のための血液）20週間の期間中に5回を減少させる。一方、我々は、造血幹細胞の数が偶数胚発生の過程で減少していることを忘れてはなりません（生理的誕生の期間）、線形細胞分化マーカーの発現の平行した、永久的な増加を伴う。

前駆細胞の臍帯血試料中の定量化に標準化されたアプローチの欠如に臍帯血の造血幹細胞の最適な用量をめぐる論争が続いています。一部の研究者は、レシピエントの体重について再計算された有核細胞および単核細胞の数、すなわちそれらの用量を、臍帯サンプルの選択基準として用いることができると考えている。いくつかの著者は、HSCの自己移植を行う場合でさえ、CD34 +細胞の最小量の閾値は2×10 ⁶ / kgであると考えている。5×10への造血細胞の投与量の増加⁶細胞/ kgの（2.5の合計）は既に、初期の移植後期間に適し提供感染性合併症の発生率を減少させ、予防抗生物質治療の期間を短縮することができます。

E.グラックマンら（1998）によれば、臍帯血細胞の成功した移植のための血液には、少なくとも3.7×10の導入である⁷受容者の体重1 kgあたりの有核細胞。1×10への造血幹細胞の投与量を減少させることによって、⁷患者劇的移植不全、再発性癌の血液増加のリスクの体重1 kgあたりの有核細胞の以下。同種移植GSK後の造血の迅速な回復のために必要な前駆細胞の最小数は、まだ不明であることを認識すべきです。理論的にはこれは、10×（1-3）少なくとも1つのセルを使用して達成するが、臨床的な骨における骨髄移植迅速かつ安定した移植保証輸血することができる⁸患者の体重1kgあたりの有核細胞。

オンコマエント学におけるHSCの最適量を決定する最近の詳細な研究には、移植材料中のCD34陽性細胞の含有量に依存して単離された3つの群の患者の観察が含まれていた。第1群の患者は、（3-5）×10 ⁶細胞/ kgを受けた。第2群の患者のHSCの用量は（5-10）×10 ⁶細胞/ kgであり、第3群の患者は10×10 ⁶ CD34 +細胞/ kg 以上の移植を受けた。最良の結果は、（3-5）×10 ⁶ / kgに等しいCD34陽性細胞の数で移植を受けるレシピエントの群において観察された。5×10 ⁶ / kgを超える移植細胞の用量の増加により、統計学的に有意な利益は確認されなかった。同時に、移植物中の非常に大きなHSC含有量（> 10×10 ⁶ / kg）は、かなりの数の残存腫瘍細胞の再注入と関連し、疾患の再発をもたらす。移植された同種前駆細胞の数と「移植片対宿主」反応の発生との間に直接の関係はなかった。

HSC臍帯血移植の世界的経験が蓄積されていることから、再増殖の可能性が高いことが確認されています。臍帯血移植の移植率は、導入された有核細胞の数と相関する。最良の結果は3×10 ⁷ / kgの移植で観察されるが、骨髄ではこの用量は2×10 ⁸ / kgである。調整センターのデータによると、臍帯血細胞の移植は2000年末には、主にドナー親族（83％）から行われた。明らかに、臍帯血は、血管芽細胞腫患者への移植のための骨髄の代替として考慮されるべきである。

しかし、造血組織の新生児自然コルドバの源は、そのGCWの機能的特徴の存在に心強いです。しかし、唯一の臨床経験は、造血の形成不全と受取人の成人の造血再構成のための臍帯血のサンプルの妥当性の質問への答えを与えることができます。白血病や骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、および神経芽細胞腫、再生不良性貧血、先天性ファンコニ貧血とダイヤモンドブラックファン、白血球接着、バール症候群、ギュンター病Harlera症候群、サラセミアの欠乏：臍帯血細胞の移植は、多くの腫瘍と非腫瘍の性質の疾患の治療に使用されています。

密接な注意と別の研究は、臍帯血の血液形成細胞の移植の免疫学的な側面に値する。骨髄よりも低い免疫反応性の臍帯血を示し、著者らによれば、ことが、不完全なHLA適合移植結果とドナーからの臍帯血の幹細胞の移植の場合に非常に満足していることが示されています。

臍帯血の細胞組成の詳細な研究は、反応「とは、宿主対移植片」の比較的低いリスクを有するHSCの供給源としての臍帯血を考慮することができるように、免疫系のエフェクター細胞の表現型スペクトルおよびそれらの機能的活性の両方の特徴を示しました。その他の機能として機能未熟免疫応答性の臍帯血細胞は、サイトカイン産生の不均衡およびサイトカインに対する感受性の減少、免疫応答の新たな規制に留意しなければなりません。細胞傷害性リンパ球活性の結果として生じる阻害は、移植された造血組織に対する免疫寛容の形成に寄与する因子と考えられる。臍帯血リンパ球集団では、成人ドナーの末梢血および骨髄とは対照的に、不活性な未成熟リンパ球およびサプレッサー細胞が優勢である。これは、免疫応答に対する臍帯血Tリンパ球の利用可能性の低下を示す。臍帯血細胞の単球集団の重要な特徴は、機能的に完全で活性な抗原提示細胞の含量が低いことである。

これらの機能は、ドナーとレシピエント細胞との間の免疫競合の強度の減少を可能にするため、一方で、臍帯血の読みにおける免疫系のエフェクター細胞の成熟度が低いが、診療所での使用にも及びます。しかし、一方で、我々は、および移植抗腫瘍効果反応「移植片対宿主病」、すなわち、「移植片対白血病」の開発の影響の程度との相関関係の存在を知っています。これに関連して、臍帯血細胞の抗腫瘍細胞毒性に関する研究が行われた。結果は、最初の場所で活性化抗原刺激に臍帯血細胞、本当に弱まった免疫応答にもかかわらず、積極的に抗腫瘍細胞傷害性の実現のメカニズムに関与しているナチュラルキラー細胞とkilleropodobnymi細胞である、ことを示しています。また、臍帯血リンパ球亜集団で表現型CD16 + CD56 +及びCD16を発見した「TCRA / Pが+。これらの細胞が活性化された形態で反応を実施しているものとする」「移植片対白血病。

腫瘍学の研究所で、臍帯血からウクライナ凍結保存造血細胞の医学科学アカデミーは、化学療法や放射線療法による造血の持続的な形成不全で癌患者に投与しました。永続的な末梢血における成熟形成された素子の上昇、ならびに細胞性および体液性免疫の状態を特徴付ける指標の増加によって証明されるように、これらの患者では、臍帯血の造血幹細胞の移植が効果、血液抑圧を回復しました。造血臍帯血細胞の移植後の効果repopulyatsionnogoの安定性は、治療を中断することなく、継続的な放射線療法と化学療法が可能になります。効率化の同種移植幹細胞臍帯血癌患者の証拠がある：その使用中の腫瘍の再発の年間リスクは、移植された同種骨髄の遺伝子を持つ患者では40％対25％でした。

凍結保存した臍帯血の幹細胞の作用機序は、造血成長因子の産生を自己分泌する新生児の細胞のユニークな能力だけでなく、確認としてドナー細胞の一時的な移植の結果（によって引き起こされる造血受信者の体液性刺激の結果として考慮されるべきである - 末梢血、胎児ヘモグロビン受け手7-15の内容が大幅に増加ベースラインデータと比較して輸血後1日）。免疫細胞のその相対許容誤差の結果だけでなく、信頼性基準凍結保存した生物学的材料の有用性 - 臍帯血輸血後反応の受信者でないこと。

前駆細胞Tは、エクスビボで新たに開発するために使用される外因性のサイトカイン刺激の影響下およびその後の移植免疫療法のための抗腫瘍細胞傷害性リンパ細胞を誘導するインビボ方法で活性化することができるキラー臍帯血リンパ球。また、臍帯血免疫細胞のゲノムの「未熟さ」は、分子モデリングによって抗腫瘍活性を高めるためにそれらを使用することができます。

今日では、臍帯血は、主に小児血液学において広く適用されている。骨髄同種移植片に比べ臍帯血の造血幹細胞の急性白血病の同種移植の小児では、大幅に「移植片対宿主の」反応の発生率を低減します。しかし、好中球減少や血小板減少、および100日死亡率移植後の、残念ながら、より高いレベルの長期にわたって注目されます。放射性ローダミンおよびその表面上のCD38抗原の低発現の吸収の低いレベルによって証明されるように、末梢血顆粒球および血小板の回復のより長い期間は、原因臍帯血のCD34陽性細胞の個々の亜集団の不十分な分化をすることができました。

同時に、原因互換性の無関係な骨髄ドナーの両方の不足だけでなく、自家HSCを動員する機会に行っ成人患者の臍帯血の造血幹細胞の移植は、30歳未満の患者では、高年次無再発生存率を示した（73％） 。レシピエントの年齢範囲の拡大（18〜46歳）により、生存率は53％まで低下した。

表現型CD34 +骨髄および臍帯血を用いた細胞の定量分析は、骨髄中のより高い（3.5倍）、その内容を示したが、臍帯血は、CD34 + HLA-DR .Izvestnoの表現型プロファイル、chtokletkikrovisimmunologicheskimiマーカーCD34を有する細胞の有意な優位性を示しました。 in vitroでの造血細胞の長期培養の成長の実験的研究で確認されたよう+ HLA-DRは、免疫CD34 + HLA-DR +を有する細胞よりも活性で増殖します。マーカーセットCD34 + CD38との臍帯血や骨髄に含まれる表現型CD34 + CD38での原始的な細胞の前駆細胞が、臍帯血細胞は、成人ドナーの骨髄から分離された同じ表現型の造血細胞よりも高いクローン原性活性を有します。加えて、CD34 + CD38の免疫と臍帯血細胞は、サイトカイン（IL-3、IL-6、G-CSF）での刺激に応答して増殖し、骨髄細胞よりも長期培養において7倍以上のコロニーを再現します。

臍帯血幹細胞バンク

適切な実用的な医学の新しい分野の発展のために - 造血骨髄幹細胞の移植を行うための臍帯血の幹細胞の移植と同様に、あなたはすでに米国とヨーロッパで確立されている血液銀行の広範なネットワークを持っている必要があります。臍帯血バンクの州内ネットワークは、Netcord Banks協会によって統一されています。臍帯血バンクの国際的な関連付けを確立することの実現可能性は無関係な移植はHLA一致ドナーを選択することができ、入力された臍帯血の多数のサンプルを必要とする実行することによって決定されます。異なるHLAタイプの血液サンプルを保管している銀行システムを確立するだけで、必要なドナーを見つける問題を本当に解決することができます。このような臍帯血組織の組織は、現在国際レベルで議論されている倫理的および法的規範の暫定的な発展を必要とする。

ウクライナで臍帯血バンクを作るためには、いくつかの規定や書類を用意する必要があります。

まず第一に、臍帯血のサンプリング、分画、凍結の方法を標準化する問題です。妊婦の病院で臍帯血をサンプリングする規則を医療倫理の要求に従って規制し、成功した移植を確実にする臍帯血の最小量を決定する必要がある。それを比較し、品質評価および造血前駆細胞ならびにHLAタイピング方法および臍帯血細胞の注入により伝達することができる遺伝的および感染症の診断の方法の多数の異なる基準の標準化は、一般的な選択基準、健康なドナーに設定されるべきです。また、臍帯血に由来する血清、細胞およびDNAのための別々の保管施設の創設について議論する価値もある。

骨髄ドナーの登録簿との関係を実施するためには、臍帯血のデータのコンピュータネットワークを編成することが絶対に必要です。細胞移植法をさらに発展させるために、臍帯血と骨髄移植の結果をHLAと同一の親族および無関係のドナーと比較するための特別なプロトコールが開発されるべきである。遺伝的および/または感染症で識別される子の母親や親戚の両親のインフォームドコンセントを含むドキュメント、だけでなく、通知を標準化することができます臍帯血細胞の臨床使用の倫理的、法的な問題に対処するには。

ウクライナにおける細胞移植の開発のための判定条件は、幹細胞の寄付とドナーの骨髄（WMDA）の世界協会、国立米国ドナーの骨髄プログラム（民主党）と、他のレジスタを介して他の国との国際協力の発展のための国家プログラムの採択となります。

臍帯血の造血幹細胞移植のまだ短い歴史を一般に、我々は70年代初期に作られた臍帯血の臨床応用の可能性の最初の仮定は、1988年に80年の間に動物での実験的研究の結果を確認し、されたことに注意してください今年は、ヒト臍帯血の造血細胞の世界初の移植を行い、その後、臍帯血バンクのグローバルネットワークを開発し始めてきました。10年後、移植された造血細胞、中でも800に臍帯血近い患者の数は、種々の腫瘍疾患（白血病、リンパ腫、固形腫瘍）及び非腫瘍（先天性免疫不全、貧血、代謝性疾患に関連する疾患）性質を有する患者でした。

臍帯血では、早期および拘束された細胞前駆体の含量は、成人の末梢血よりも高い。顆粒球 - マクロファージコロニー形成単位の数およびそれらの増殖能により、成長因子の導入後でさえ、臍帯血は成人の末梢血を有意に超える。インビトロでの長期間の細胞培養では、骨髄細胞よりも臍帯血細胞の増殖活性および生存能が高かった。臍帯血の幹細胞の移植における重要な瞬間は、造血潜在的な数と有核細胞、サイトメガロウイルス感染、HLA適合性のドナーとレシピエント、体重および患者の年齢の存在です。

それにもかかわらず、臍帯血の幹細胞移植は、特に小児において、重度の血液疾患を治療するために、骨髄移植の代替として考慮されるべきである。臍帯血細胞の移植の臨床的問題は徐々に解決 - 、既に非常に効率的なサンプリング技術、分離及び臍帯血細胞の凍結保存があり、臍帯血バンクを形成するための条件を提供し、試験方法は、有核細胞を向上させることができます。バンクの確立に大規模プリフォーム臍帯血造血幹細胞の間の最適な分離は、ゼラチンの3％水溶液及び6％のヒドロキシエチルデンプン溶液としてみなされるべきです。

Perehrestenko P.ら（2001）は正しく、臍帯血の幹細胞の移植は、GSKの臍帯血を採取が比較的容易である重要その中の重要な利点の数が異なるように、種々の起源の造血の低下を克服するために、複雑な治療手段でその正当な場所を取る必要があることを指摘しますドナーへの危険性がなく、新生児細胞のウイルスによる汚染が少なく、移植費用が比較的低い。一部の著者は、骨髄細胞よりも少ない頻度で臍帯血細胞の移植は、彼らの見解では、HLA-DR抗原との臍帯血細胞における弱い発現によるものである「移植片対宿主」の反応、に関連する合併症を伴うことを示唆している彼らの未熟さ。それにもかかわらず、臍帯血の有核細胞の主要な集団は、そのコンテンツ成人の末梢血中の20％未満、約50％であり、Tリンパ球（SDZ陽性細胞）が、これらのT細胞の亜集団の表現型の違いがありますソースは重要ではありません。

直接臍帯血の幹細胞移植の生存に影響を与える要因の中で、私たちは患者さん（最良の結果は、5歳までの受信者に見られている）、疾患の早期診断の年齢や白血病の形（効率が急性白血病でかなり高いです）注意してください。非常に重要なのは、有核臍帯血細胞の投与量、ならびにその受容者とのHLA適合性である。 - 唯一の29％を、この場合の1年間の無病生存率は無関係な移植のに対し、63％に達した。これは、腫瘍学および血液学における臍帯血移植GSKの臨床的有効性のない事故分析は、関連する移植を使用して、治療の最良の結果を示していないです。

したがって、臍帯血および新生児の造血幹細胞は、血液悪性腫瘍患者における同種移植に適するように高いrepopulyatsionnaya能の幹細胞の多数の存在。通常6ヶ月後に、末梢血好中球回復量は通常6週目の終わりに向かって発生し、血小板減少症の現象が消える：しかし、臍帯血の造血幹細胞移植後の造血の要約は、「時間に延伸された」ことに注意してください。受信者の23及び25％にそれぞれ観察された急性および慢性の反応「宿主対移植片」の厳しいコース：また、臍帯血の未熟造血細胞は、免疫学的競合を排除するものではありません。臍帯血細胞を移植した後の最初の年の終わりまでに急性白血病の再発は、例26％で発見されています。

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