臍帯血由来造血幹細胞
最後に見直したもの： 04.07.2025
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臍帯血は、造血細胞の増殖能と再生能力の点で、造血幹細胞の優れた供給源です。出生時には、臍帯血に弱く分化誘導された造血前駆細胞が十分に多く含まれていることが繰り返し示されています。一部の研究者は、臍帯血造血幹細胞移植の利点は、HLA抗原に適合するドナーを探す必要がないことだと考えています。彼らの見解では、新生児の免疫系は未熟であるため、免疫担当細胞の機能活性が低下し、その結果、骨髄移植よりも重篤な移植片対宿主病の発生率が低くなります。同時に、患者の体重1kgあたりに投与される造血幹細胞の数が少ない場合でも、臍帯血移植の生存率は骨髄細胞の生存率を下回ることはありません。しかし、私たちの意見では、レシピエントの体内に効果的に生着するために必要な移植臍帯血細胞の最適な数、それらの免疫適合性、および臍帯血造血幹細胞の移植の問題のその他の多くの側面については、より真剣な分析が必要です。
[ 臍帯血からの造血幹細胞の採取
臍帯血から造血幹細胞を採取するには、出生直後に臍帯血を採取し、胎盤が子宮内または子宮外にあるとき、また帝王切開時だけでなく子宮外においても胎盤から分離する必要があります。出生から新生児が胎盤から分離するまでの時間を30秒に短縮すると、得られる臍帯血の量は平均25～40ml増加することが示されています。この処置を後で行うと、同量の血液が失われます。早期に胎盤から分離しても新生児に悪影響はないことが確認されています。
ロシア血液学・輸血学研究所は、通常分娩（(70.2+25.8) ml）と帝王切開（(73.4+25.1) ml）の両方で臍帯血を採取するための効果的かつ低コストの技術を開発しました。有核細胞と単核細胞の収量を十分に高く（それぞれ(83.1+9.6)%と(83.4+14.1)%）臍帯血を分離する方法が提案されました。臍帯血の凍結保存方法も改良され、単核細胞とCFU-GMの高い保存率（それぞれ(96.8+5.7)%と(89.6+22.6)%）が保証されました。Kompoplast-300容器（ロシア）を用いた臍帯血採取のためのドレナージ法の効率が判明しました。著者らは、出産直後および胎盤からの分離直後に、胎盤が子宮内または子宮外にある状態で臍帯血を採取した。臍帯静脈を穿刺する前に、臍帯を5％ヨウ素チンキで1回、次に70％エチルアルコールで2回処理した。血液は接続チューブを通って容器に自然に流れ込んだ。採取手順は10分以内で完了した。ドレナージにより採取された66の臍帯血サンプルの平均量は（72+28）mlで、平均全サンプル量中の白血球数は（1.1+0.6）×107であった。臍帯血の無菌性（細菌汚染、HIV-1、B型およびC型肝炎ウイルス、梅毒、サイトメガロウイルス感染）を分析したところ、C型肝炎ウイルスに対するIgG抗体が検出されたサンプルは1つだけであった。別の研究では、出生直後に胎盤を胎児の表面を下にして特別なフレーム上に配置し、臍帯を5％ヨウ素溶液と75％エチルアルコールで処理しました。臍帯静脈は輸血システム（G16）の針を使用してドレナージしました。血液は自然に容器に流れ込みました。この方法で採取された血液の平均量は（55±25）mlでした。 G. Koglerら（1996）の研究では、臍帯血は閉鎖法を使用して採取され、平均（79±26）mlという大量の血液が得られました。著者らは、574の臍帯血サンプルのうち約7％に40ml未満の血液が含まれており、移植に使用できないことを指摘しています。 K. Isoyamaら。 (1996)は、注射器を用いた能動的な臍帯血採取法で、平均69.1mlの臍帯血（臍帯血量は15～135ml）を採取しました。最後に、A. Abdel-Mageed PIら (1997)は、臍帯静脈カテーテルを用いて平均94ml（56～143ml）の臍帯血を採取しました。
医原性感染および母体分泌物による汚染のリスクを低減するため、米国イリノイ州ディアフィールドのバクスター ヘルスケア社が広く使用している輸血システムをベースに、抗凝固剤として CPDA (クエン酸・リン酸・デキストロースとアデニン) 62.5 ml を含む閉鎖型血液採取システムが開発されました。 材料を採取する技術は、細胞懸濁液の量、内容、純度の点で高品質のサンプルを調製するために最も重要です。 臍帯血を採取する既存の方法は、通常、閉鎖型、半開放型、開放型に分類されますが、閉鎖型は材料の微生物汚染のリスク、および細胞懸濁液の母体細胞による汚染のリスクを大幅に低減するため、前者を優先する必要があります。
A. Nagler ら (1998) は、臍帯血を採取する 3 つのシステムすべての効率の比較分析を実施しました。第 1 の方法で手順は閉鎖系で行われ、血液が直接容器に剥離されました。第 2 の方法で臍帯血は、MP1 シリンジで血液を能動的に滲出させ、続いて胎盤静脈をフラッシュし、同時に血液を容器に排出することによって得られました (オープン法)。第 3 の方法で血液は半オープン システムで採取され、シリンジで血液を能動的に抽出し、臍帯動脈を通してフラッシュし、同時に容器に滲出させました。第 1 の方法で著者らは (76.4+32.1) ml の容積の臍帯血を取得し、白血球数は 1 ml の血液中 (10.5+3.6) x 10 6でした。 2番目の変種では、対応する指標は(174.4+42.8) mlおよび(8.8+3.4) x 10 6 /mlでした。3番目の変種では、(173.7+41.3) mlおよび(9.3+3.8) x 10 6 /mlでした。臍帯血サンプルで最も頻繁に感染が観察されたのは、オープンシステムを使用した場合でした。胎盤重量と採取された血液量の間には直接的な相関関係が認められ、胎盤重量が増加すると、採取された血液量も増加しました。
臍帯血採取後、分離段階、すなわち単核細胞の分離と赤血球からの細胞懸濁液の精製が続く。実験条件では、塩化アンモニウムで赤血球を溶解する際にメチルセルロースで沈降させることで核細胞を分離する。しかし、メチルセルロースは造血幹細胞の損失が50～90%に達するため、臨床目的では使用すべきではない。赤血球の溶解は、作業溶液の容量が大きいため、臨床ではほとんど行われないが、この方法でCD34+表現型の核細胞、およびCFU-GMとCFU-GEMM機能を持つ前駆細胞の分離率は大幅に高くなる。密度勾配で単核細胞を分離する新しい手段、バイアント密度溶液（BDS72）の出現が報告されている。この物質の生理学的パラメータは、pH 7.4、浸透圧 280 mOsm/kg、密度 1.0720 g/mlです。著者らによると、CD34陽性細胞を最大100%分離し、赤血球を98%除去できるとされています。しかしながら、BDS72はまだ臨床使用されていません。
臍帯血から有核細胞を分離する承認された方法では、通常、10%ヒドロキシエチルデンプン溶液または3%ゼラチン溶液が用いられる。どちらの場合も、赤血球の沈降効率および有核細胞の分離効率はほぼ同等である。しかし、沈降剤としてゼラチンを用いた場合、ヒドロキシエチルデンプンを用いた場合よりもわずかに多くのCFU-GMを得ることができる。CFU-GMの分離効率の差は、有核細胞の各分画の沈降速度の差、またはヒドロキシエチルデンプン分子が造血細胞受容体の表面に吸着し、in vitroでのCFU-GMの培養に使用されるコロニー刺激因子に対する感受性を阻害する能力によるものと考えられる。とはいえ、大規模な臍帯血バンクを構築する場合、どちらの沈降装置も有核細胞の分離に適していると考えられる。
臍帯血の分離および凍結保存の方法は、成人ドナーの末梢血および骨髄から得られる造血幹細胞の研究で用いられる方法と基本的に変わりません。しかし、臍帯血バンク用に大量の臍帯血サンプルを調製する場合、分離方法は何よりも低コストでなければなりません。そのため、残念ながら現状では、臨床ニーズに対応するために、既に検証済みの臍帯血細胞の分離および凍結保存方法が用いられており、より効果的だがコストのかかる方法が依然として実験者の手に委ねられています。
造血細胞数の評価基準と、感染性病原体を特定するための臍帯血検体の検査要件は、概ね承認されている。臍帯血造血細胞移植の安全性を確保するため、すべての血液検体は、主に造血性感染症および遺伝性疾患について検査されなければならない。α-サラセミア、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ブルトン型無ガンマグロブリン血症、ハーラー病、ポンター病などの遺伝性疾患を診断するために、臍帯血を検査するための特別な追加検査法を推奨する研究者もいる。
L. Ticheliら（1998）の推奨によれば、臍帯血の各検体は、有核細胞、CD34陽性細胞、CFU-GMの検査、HLAタイピング、ABO式血液型とRh因子による血液型の判定が必須です。さらに、細菌培養、HIVおよびサイトメガロウイルス感染症、HBs抗原、C型肝炎ウイルス、HTLY-IおよびHTLV-II（ヒトT細胞白血病）、梅毒、トキソプラズマ症の血清学的検査を実施する必要があります。サイトメガロウイルスおよびHIV感染症に対するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）検査は必須です。
臍帯血採取の手順は、医療倫理の原則に厳密に従って実施されなければなりません。採血前に、妊婦から採取の同意を得る必要があります。採血から書類の記入まで、すべての処置について妊婦と事前の面談を行い、インフォームドコンセントを得る作業は、医療従事者のみが行います。これらの手順は、生物学、化学、薬学、その他の非医学分野の教育を受けた者による実施は、既存の生命倫理および人権規範に反するため、いかなる場合も認められません。HBs抗原保有検査で陽性反応が出た場合、C型肝炎、HIV感染、梅毒の病原体に対する抗体が存在する場合、臍帯血は採取されず、採取済みの血液サンプルは廃棄されます。新生児における潜在性感染の保有は成人に比べてはるかに少ないため、臍帯血造血細胞の注入中に血行性移行や感染性合併症が発生する可能性は、移植に成人ドナーの骨髄を使用する場合よりも大幅に低いことに留意する必要があります。
臍帯血の臨床応用における重要な側面の一つは、移植評価です。これは、臍帯血サンプル中の造血幹細胞の量と、移植に必要な細胞量を決定することに基づいています。現在、移植に必要な臍帯血細胞の最適な量に関する基準は確立されていません。CD34陽性細胞数やCFU-GMといった日常的なパラメータに関しても、一般的に受け入れられている見解は存在しません。一部の研究者は、顆粒球、赤血球、単球、巨核球に共通するコロニー形成単位（CFU-GEMM）の含有量を測定しながら長期培養物を分析することで、造血細胞の潜在能力を評価しています。
しかし、臨床現場では、臍帯血移植の標準的な評価には通常、有核細胞または単核細胞の数の測定のみが含まれます。
臍帯血造血幹細胞の保存
臍帯血造血細胞の保存技術にもいくつかの課題があります。造血幹細胞を凍結保存する場合、最適な凍結モードを実現するために、臍帯血の量を可能な限り減らすとともに、溶血や赤血球抗原（ABO、Rh）不適合反応のリスクを回避するために、事前に赤血球を除去する必要があります。これらの目的には、有核細胞を分離するさまざまな方法が適しています。前世紀の90年代初頭には、密度1.077 g / mlのフィコールまたは密度1.080 g / mlのパーコールに基づく密度勾配で有核細胞を分離する方法が最も広く使用されていました。密度勾配で臍帯血を分離すると、主に単核細胞を分離できますが、造血前駆細胞が最大 30 ～ 50% 失われます。
臍帯血造血細胞の分離過程におけるヒドロキシエチルデンプンの沈降効率については、様々な評価がなされています。この方法による分離品質の低さを指摘する研究者もいれば、一方で、あらゆる方法の中で、6%ヒドロキシエチルデンプン溶液を用いた臍帯血造血幹細胞の分離を最優先とする研究者もいます。同時に、造血細胞の沈降効率の高さも強調されており、いくつかのデータによると、その効率は84%から90%に達します。
異なる視点を持つ支持者は、事実上すべての分画法は有核細胞の大きな損失を伴うと考え、遠心分離による分離を行い、臍帯血を赤血球、白血球リング、血漿の3つの分画に分けることを提唱している。著者らは、この方法で細胞を分離した結果、単核細胞、初期造血前駆細胞、CD34+免疫表現型細胞の含有量が、それぞれ初期レベルの90%、88%、100%に達したことを発見した。この方法で精製された臍帯血細胞の増加について、他の研究者らも同様の値を得た。沈降後、有核細胞の92%、単核細胞の98%、CD34陽性細胞の96%、コロニー形成単位の106%が分離された。
1990年代後半、ゼラチンは沈降剤として広く使用されていました。臨床現場では、1994年から臍帯血からの造血幹細胞の分離にゼラチンが使用されています。3%ゼラチン溶液を用いた場合、有核細胞の分離効率は88～94%に達します。臍帯血バンクの構築におけるゼラチンの大規模使用により、他の沈降剤に対する優位性が実証されています。上記のすべての有核細胞分離法を、試験した各臍帯血サンプルに対して連続的に使用した条件下での効率の比較分析により、CD34+/CD45+表現型の単核細胞の収量、およびCFU-GMとCFU-GEMMの数の観点から、3%ゼラチン溶液が最適な沈降剤であることが証明されました。フィコール密度勾配法、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロースを使用した方法は効果が著しく低く、造血細胞の損失は 60% に達しました。
臍帯血幹細胞移植件数の拡大は、その採取方法の開発だけでなく、保存方法の開発にも関連しています。長期保存のための臍帯血の調製と、そのサンプルの凍結保存に最適な技術の選択には、直接関連する多くの課題があります。その中には、分離手順の実施可能性、様々な凍結保存媒体の使用、そして移植用解凍細胞の調製方法の適用といった問題があります。生来の臍帯血サンプルの輸送は、血液学センターから遠隔地から行われることがよくあります。この点で、採取から凍結保存開始までの臍帯血の許容保管期間の問題が生じ、これは臍帯血バンクの設立において特に重要です。
臍帯血を液体窒素中で長期保存（最長12年）した後の造血細胞の機能活性に関する研究では、この期間中に約95%の造血細胞が高い増殖能力を失わないことが示されています。S. Yurasovと共著者（1997）の研究では、臍帯血を室温（22°C）または4°Cで24時間および48時間保存しても、造血細胞の生存率に大きな低下はなく、それぞれ初期レベルの92%と88%であることが証明されています。ただし、保存期間を3日間に延長すると、臍帯血中の生存核細胞数が大幅に減少します。同時に、他の研究では、22°Cまたは4°Cで2～3日間保存した場合、造血細胞ではなく成熟顆粒球の生存率が最初に損なわれることが示されています。
臍帯血造血幹細胞の生存率は、臍帯血採取システムの成分によって悪影響を受ける可能性があります。カルシウムイオン結合を作用機序とする様々な抗凝固剤（ACD、EDTA、XAPD-1）が、臍帯血を24～72時間保存した造血前駆細胞に及ぼす影響を解析した結果、有核細胞の生存率に悪影響を及ぼすことが明らかになりました。この点に関して、著者らは、防腐剤を含まない天然ヘパリンを20 U/mlの濃度で添加したPBS（リン酸緩衝液）の使用を推奨しています。著者らの見解では、これにより未分画臍帯血の保存期間を72時間まで延長でき、コロニー形成単位の機能活性を維持できるとのことです。ただし、CFU-GMおよびCFU-Gの安全性に関する研究では、凍結保存前の臍帯血の保存時間は9時間を超えてはならないことが示されています。明らかに、この場合に適用されるべき原則は、矛盾するデータが存在する場合、臍帯血の最小推奨保管期間を使用し、分離された細胞のプログラムされた凍結をできるだけ早く開始する必要があるということです。
臍帯血造血幹細胞を凍結する際には、通常、凍結保護剤として10% DMSO溶液が使用されます。しかし、この濃度のジメチルスルホキシドは、顕著な凍結保護効果に加え、臍帯血造血細胞への曝露が最小限であっても、直接的な細胞毒性効果を有します。DMSOの細胞毒性効果を低減するために、曝露温度をゼロにし、すべての操作速度を上げ、臍帯血サンプルの解凍後に複数回の洗浄を実施します。
ウクライナ医学アカデミー血液学・輸血学研究所は、1995年以来、造血幹細胞の代替供給源としての臍帯血の包括的な研究を目的とした科学的方向性を発展させてきました。特に、未分画および分画臍帯血の造血細胞を低温で凍結保存するための新技術が開発されました。凍結保護剤として、低分子医療用ポリビニルピロリドンが使用されています。未分画臍帯血の凍結保存法は、凍結前の細胞前処理のための独自の技術と、移植直前の細胞懸濁液の特殊処理法に基づいています。
凍結保存された造血幹細胞の機能活性レベルに影響を与える最も重要な要因の一つは、細胞懸濁液の冷却速度、特に結晶化段階における冷却速度です。凍結速度と凍結時間の問題を解決するソフトウェアアプローチは、移植前に細胞懸濁液を凍結保護剤から洗浄することなく、簡便かつ非常に効果的な凍結保存方法を開発する大きな可能性をもたらします。
細胞調製における細胞の生存にとって最も危険な段階は、直接凍結と解凍の段階です。造血細胞を凍結すると、細胞間媒体が液体から固体へと変化する瞬間、すなわち結晶化の瞬間に、細胞の大部分が破壊される可能性があります。細胞死の割合を低減するために、凍結保護剤が使用されます。その作用機序と凍結保護効果は、科学文献で十分に説明されています。
骨髄細胞および臍帯血細胞の凍結保存方法を最適化するための有望な方向性として、細胞内レベルで作用する DMSO と細胞外保護効果を持つヒドロキシエチルデンプンまたはアルブミンなど、作用機序の異なる複数の凍結保護剤を 1 つの溶液に低濃度で組み合わせるという方法があります。
臍帯血細胞の凍結保存には、20% DMSO溶液が伝統的に用いられます。氷浴中で機械的に一定量撹拌しながら、この溶液を細胞懸濁液にゆっくりと注ぎ、凍結保護剤と細胞懸濁液の体積比が等量（1:1）になるまで続けます。ジメチルスルホキシドの最終濃度は10%です。その後、細胞懸濁液はプログラムされた低温装置でGS/分の速度で-40°Cまで冷却され、その後、冷却速度は10°C/分に上げられます。-100°Cに到達した後、細胞懸濁液を入れた容器は液体窒素（-196°C）に置かれます。この凍結保存技術により、解凍後の機能的に活性な単核細胞の保存率は、元のレベルの85%に達します。
凍結保存方法の改良は、ヒドロキシエチルデンプンを添加することでDMSO濃度を低減することを目的としている（ジメチルスルホキシドとヒドロキシエチルデンプンの最終濃度はそれぞれ5%と6%）。このような凍結保護剤の組み合わせは、骨髄細胞懸濁液を凍結する際に高い効率を示し、ジメチルスルホキシドの10%溶液のみを使用した場合と同等の細胞保護効果を示した。生存核細胞数は初期値の96.7%に達し、CFU-GM数で推定した機能活性は81.8%であった。
5～10%の濃度のジメチルスルホキシド溶液を4%のヒドロキシエチルデンプン（最終濃度）と組み合わせて使用した場合、この濃度範囲のジメチルスルホキシドではCD34陽性細胞の安全性は実質的に変わらないことが分かりました。同時に、ジメチルスルホキシドの濃度が5%から2.5%に低下すると、臍帯血細胞の大量死が観察され、生存細胞数は85.4%から12.2%に減少しました。他の著者らも、臍帯血造血幹細胞の凍結保存中に最大の効率で細胞保護効果をもたらすのは、5%および10%のジメチルスルホキシド溶液（著者のバージョンでは自己血清との組み合わせ）であると結論付けています。さらに、5%または10%のジメチルスルホキシドと4%ヒドロキシエチルデンプン溶液を組み合わせた場合、特にGS/分に制御された冷却速度で連続的に凍結・解凍した細胞の高い保存性が確認されています。別の研究では、DMSO、精製ヒトアルブミン、RPMI培地の3つの成分を1:4:5の比率で混合した凍結保護溶液を使用し、細胞懸濁液に等量添加しました（ジメチルスルホキシドの最終濃度は5%）。+4GSの温度でウォーターバスで解凍した後、CFU-GMの保存率は94%を超えました。
赤血球を除去する過程でかなりの量の造血細胞が失われるため、一部の著者は未分画臍帯血を凍結保存に使用することを提案しています。この方法では、単核細胞を凍結結晶化による損傷から保護するために、ジメチルスルホキシドの10%溶液が使用されます。凍結は、GS/分の一定冷却速度で-80℃まで行われ、その後、臍帯血細胞懸濁液は液体窒素に浸されます。この凍結法では赤血球が部分的に溶解されるため、血液サンプルを分画する必要はありません。解凍後、細胞懸濁液はヒトアルブミン溶液または患者の自己血清で遊離ヘモグロビンとジメチルスルホキシドから洗浄され、移植に使用されます。
未分画臍帯血の解凍後の造血前駆細胞の保存性は、分画臍帯血よりも確かに高いですが、一部の赤血球の凍結安定性のため、ABO不適合赤血球の輸血により深刻な輸血後問題が発生する可能性があります。また、未分画血の保存量が大幅に増加します。臨床的な観点からは、他の細胞分画から分離・精製された臍帯血造血細胞を凍結保存することが依然として望ましいと考えられます。
特に、凍結準備段階で赤血球を除去することを可能にする分画臍帯血細胞の凍結保存法が開発されました。この方法では、血漿代替液「スタビゾール」の一部としてヒドロキシエチルデンプンの6%溶液が使用されます。このようにして得られた細胞懸濁液は、解凍後、追加の操作なしに臨床使用にすぐに使用できます。
このように、現在、臍帯血の凍結保存には非常に効果的な方法が数多く存在します。それらの根本的な違いは、血液サンプルを未分画のまま凍結するか、調製段階で細胞分画に分離し、赤血球が混入していない有核細胞を調製するかという点です。
臍帯血造血幹細胞移植
1980年代後半から1990年代前半にかけて、妊娠中に胎児の生命維持に必要となる臍帯血に、造血幹細胞が豊富に含まれることが確認されました。臍帯血細胞の採取が比較的容易で、倫理的な問題もほとんどないことから、臍帯血幹細胞は医療現場で広く利用されるようになりました。ファンコニ貧血の小児への臍帯血移植が初めて成功したことをきっかけに、臍帯血幹細胞移植の件数が増加し、臍帯血を保管するシステムが構築されました。世界の臍帯血バンクシステムの中で最大のものは、米国国立衛生研究所の傘下にあるニューヨーク胎盤血センターです。このバンクに保管されている臍帯血サンプルの数は2万件近くに達しています。また、移植が成功したレシピエント（主に小児）の数も増加しています。米国保健省によれば、臍帯血移植を受けた患者の移植後の再発のない期間は、すでに10年を超えている。
これは驚くべきことではありません。なぜなら、臍帯血の造血ポテンシャルに関する数多くの研究において、初期幹細胞の量と質において、成人の骨髄に劣らないどころか、いくつかの点でそれを凌駕していることが示されているからです。臍帯血幹細胞の高い増殖ポテンシャルは、細胞シグナル伝達の個体発生的特徴、造血幹細胞（HSC）上の特定の成長因子受容体の存在、臍帯血細胞の成長因子の自己分泌産生能力、そしてテロメアの大きさと長さに起因しています。
したがって、臍帯血造血幹細胞のゲノム特性と表現型特性により、移植片の高品質な生着が決定され、レシピエントの体内でドナーの造血が回復する可能性が高いことが分かります。
臍帯血造血幹細胞の利点
臍帯血造血幹細胞を移植に用いることによる、他の造血細胞源に対する実質的な利点としては、ドナーの健康リスクが実質的にゼロであること（胎盤を除外した場合）と、全身麻酔が不要であることが挙げられる。臍帯血の使用は、部分的なHLA適合移植（1～3抗原の不適合）により、細胞移植の可能性を広げる。臍帯血造血細胞を凍結状態で長期保存する方法が開発されており、希少HLA型を得られる可能性が高まり、同種移植のためのHLA適合移植片を探す時間が短縮される。同時に、感染性手段によって伝播する特定の潜伏感染症を発症するリスクも大幅に低減される。さらに、臍帯血細胞を自家移植に用いることで、安価な生物学的生命保険の役割を果たすことも可能となる。
しかし、胎盤から採取できる血液の量が少ない（平均100ml以下）ため、採取した臍帯血サンプルの細菌汚染リスクを最小限に抑える条件を厳密に守りながら、臍帯静脈から可能な限り最大量の血液を採取するという問題が浮上します。
臍帯血中の原始造血細胞は、通常、細胞表面のCD34糖リンタンパク質の存在によって同定されるほか、in vitroでのクローン形成能やコロニー形成能の研究によって機能特性に基づいて同定される。比較分析の結果、臍帯血と骨髄では、単核分画中のCD34陽性細胞の最大含有量はそれぞれ1.6%と5.0%、CD34+細胞亜集団中のコロニー形成単位の最大レベルは80%と25%、CD34+細胞の総クローン効率は88%と58%、高増殖能コロニー形成細胞（CD34+集団中のHPP-CFC）の最大含有量は50%と6.5%であることが示された。さらに、臍帯血造血幹細胞では、CD34+CD38細胞のクローン効率とサイトカイン刺激に対する応答能力も高い。
Thy-1、CD34、CD45RAという表現型抗原の組み合わせは、臍帯血造血細胞の高い増殖能を裏付けており、臍帯血細胞表面におけるこれら3つの抗原の発現は、それらが幹細胞に属することを示しています。さらに、臍帯血には、線形分化のマーカーを持たないCD34+表現型の細胞が含まれていることが確認されました。臍帯血中におけるCD34+/Linという表現型プロファイルを持つ細胞サブポピュレーションのレベルは、CD34陽性細胞の総数の約1%です。臍帯血の造血前駆細胞は、リンパ球系細胞株と多能性骨髄球系線形細胞系の両方に分化することから、幹細胞に属することが示唆されます。
既に述べたように、骨髄と臍帯血の大きな違いは、1回の採取手順で得られる移植用造血細胞の量にあります。骨髄移植の場合、分離、凍結保存、解凍、検査の過程で細胞量の損失が40～50%以内であれば許容されますが、臍帯血の場合、このような細胞損失は非常に大きくなります。なぜなら、造血幹細胞の量が不十分だと、移植が効果的に行われない可能性があるからです。G. Koglerら（1998）によると、レシピエントの体重10kgの細胞移植では、すべての臍帯血サンプルが移植対象となり得ます（採取された臍帯血サンプルの総数は2098）。体重35kgの患者では、その67%が移植対象となります。一方、体重50～70kgの患者では、有効な移植を提供できるサンプルはわずか25%です。この臨床状況は、臍帯血細胞の採取、再生、保存における既存の方法の効率を最適化し、改善する必要があることを示しています。そのため、文献では現在、血液バンクを作るために臍帯血を採取、検査、分離、凍結保存する方法の標準化や、臨床での使用、また臍帯血の造血幹細胞の保管条件や期間の規定といった問題が広く議論されている。
臍帯血造血幹細胞の医療への利用
通常、臍帯血からは最大 10 6 個の造血幹細胞を分離できますが、それ以上になることは稀です。この点で、臍帯血からのこの量の造血細胞が成人レシピエントの造血を回復するのに十分であるかどうかという疑問は、今日まで未解決のままです。この問題については意見が分かれています。研究者の中には、この量は小児への移植には十分ですが、成人への移植には少なすぎると考える人もいます。成人の場合、最適量は体重 1 kg あたり(7-10) x 10 6 個のCD34 陽性細胞、つまり移植 1 回あたり平均 7 x 108 個の導入です。これらの計算から、臍帯血 1 サンプルに含まれる造血幹細胞の数は、成人患者への 1 回の移植に必要な数の 700 分の 1 ということになります。しかし、このような定量的な評価は、輸血された骨髄細胞の数との類推によって行われるものであり、造血の発生学的特徴をまったく考慮していません。
特に、臍帯血造血幹細胞は骨髄造血前駆細胞よりも増殖能が高いという事実が無視されている。in vitroコロニー形成能試験の結果は、臍帯血1回投与で成人レシピエントの造血を再構築できることを示唆している。一方で、臍帯血幹細胞の数は胚発生中にも減少することを忘れてはならない。臍帯血中のCD34陽性細胞含有量は、妊娠20週（本研究の血液は妊娠の早期中絶時に採取された）から妊娠40週（生理的陣痛期）までの期間に5倍直線的に減少し、この期間には直線的な細胞分化マーカーの発現が並行して永続的に増加する。
臍帯血サンプル中の造血幹細胞の定量的評価には標準化された手法がないため、臍帯血造血幹細胞の最適な投与量に関する議論は依然として続いています。一部の研究者は、レシピエントの体重に応じて再計算された有核細胞と単核細胞の数、すなわち投与量を、臍帯血サンプルの選択基準として使用できると考えています。また、CD34陽性細胞の最小定量閾値は、たとえHSCの自家移植であっても2 x 10 6個/kgであると考える研究者もいます。同時に、造血細胞の投与量を5 x 10 6個/kg（わずか2.5倍）に増やすだけでも、移植後早期の経過がより良好になり、感染性合併症の発生率が低下し、予防的抗生物質療法の期間が短縮されます。
E. Gluckman ら (1998) によると、腫瘍血液学において臍帯血細胞移植が成功するための条件は、レシピエントの体重 1 kg あたり少なくとも 3.7 x 10 7 個の有核細胞の導入です。造血幹細胞の投与量が患者の体重 1 kg あたり 1 x 107 個以下の有核細胞に減らされると、移植失敗および血液がんの再発のリスクが急激に増加します。HSC の同種移植後に造血の急速な回復に必要な最少数の幹細胞数はまだ不明であることを認識する必要があります。理論的には 1 個の細胞で達成できますが、骨髄移植の臨床現場では、患者の体重 1 kg あたり少なくとも (1-3) x 10 8 個の有核細胞を輸血することで迅速かつ安定した生着が保証されます。
腫瘍血液学における最適な造血幹細胞数を決定するための最近の詳細な研究では、移植材料中のCD34陽性細胞の含有量に応じて患者を3つのグループに分け、観察を行いました。第1グループの患者には（3～5）×10 6個/kgの造血幹細胞が投与されました。第2グループの患者への造血幹細胞投与量は（5～10）×10 6個/kg、第3グループの患者には10×106個/kgを超えるCD34陽性細胞が移植されました。最良の結果は、CD34陽性細胞数が（3～5）×10 6個/kgの移植を受けたレシピエントグループで観察されました。移植細胞の投与量が5×10 6個/kgを超えても、統計的に有意な利点は認められませんでした。この症例では、移植片中の造血幹細胞の含有量が非常に高い（10 x 10 6 /kg超）ため、残存腫瘍細胞が大量に再注入され、疾患の再発につながる可能性があります。移植された同種造血幹細胞の数と移植片対宿主反応の発現との直接的な関連性は確立されていません。
臍帯血移植に関する世界的な蓄積された経験は、その高い再生能力を裏付けています。臍帯血移植の生着率は、導入された有核細胞数と相関しています。最良の結果は、移植量3 x 10 7 /kgで得られ、骨髄の場合は2 x 10 8 /kgです。連携センターのデータによると、2000年末までに世界中で1,200件の臍帯血移植が行われ、そのほとんどが血縁ドナー（83%）からの移植でした。血芽球腫患者への移植において、臍帯血は骨髄の代替として検討されるべきであることは明らかです。
同時に、臍帯血由来の造血組織は新生児期に採取されたものであり、その造血幹細胞の機能的特徴から、将来への期待が高まっています。一方で、造血無形成症の成人患者において、臍帯血1検体で造血機能を回復できるかどうかという疑問については、臨床経験のみが答えを出せる唯一の方法です。臍帯血細胞移植は、白血病、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、再生不良性貧血、先天性ファンコニ貧血およびダイアモンド・ブラックファン貧血、白血球接着不全症、バー症候群、ギュンター病、ハーラー症候群、サラセミアなど、多くの腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患の治療プログラムに用いられています。
臍帯血造血細胞移植の免疫学的側面は、綿密な検討と別途の研究に値する。HLA適合性が不完全なドナーからの臍帯血幹細胞移植の場合、移植結果は非常に良好であることが示されており、著者らによれば、これは臍帯血細胞の免疫反応性が骨髄細胞よりも低いことを示している。
臍帯血の細胞組成を詳細に研究した結果、免疫系のエフェクター細胞の表現型スペクトルと機能活性の両方の特徴が明らかになり、臍帯血は「移植片対宿主」反応を発現するリスクが比較的低い造血幹細胞の供給源として考えられるようになりました。臍帯血の免疫担当細胞の機能的未熟性の兆候としては、サイトカイン産生の不均衡と、免疫応答におけるサイトカイン調節に対する感受性の低下が挙げられます。結果として生じる細胞傷害性リンパ球の活性抑制は、移植された造血組織に対する免疫寛容の形成に寄与する因子と考えられています。成人ドナーの末梢血および骨髄とは対照的に、臍帯血リンパ球集団では、不活性で未熟なリンパ球と抑制細胞が優勢です。これは、臍帯血Tリンパ球の免疫応答に対する準備性が低下していることを示しています。臍帯血細胞の単球性集団の重要な特徴は、機能的に完全かつ活性な抗原提示細胞の含有量が少ないことです。
一方で、臍帯血中の免疫系エフェクター細胞の成熟度が低いことは、ドナーとレシピエントの細胞間の免疫衝突の強度を低下させるため、臨床における臍帯血の使用適応を拡大しています。しかし他方では、「移植片対宿主」反応の発現度と移植の抗腫瘍効果、すなわち「移植片対白血病」効果の発現との間に相関関係があることが知られています。この点に関して、臍帯血細胞の抗腫瘍細胞傷害性に関する研究が行われました。得られた結果は、免疫能のある臍帯血細胞の抗原刺激に対する反応が著しく弱まっているにもかかわらず、主に活性化されるリンパ球は、抗腫瘍細胞傷害性の発現メカニズムに積極的に関与するナチュラルキラー細胞およびキラー様細胞であることを示唆しています。さらに、臍帯血中にはCD16+CD56+およびCD16"TCRa/p+表現型を有するリンパ球のサブポピュレーションが認められました。これらの細胞は活性化された状態で「移植片対白血病」反応を引き起こすと考えられています。
ウクライナ医学アカデミー腫瘍学研究所では、化学療法および放射線療法による持続的な造血低形成を有する癌患者に対し、凍結保存された臍帯血造血細胞を投与しました。これらの患者において、臍帯血造血幹細胞の移植は、末梢血中の成熟形成因子含有量の持続的な増加、ならびに細胞性免疫および体液性免疫の状態を示す指標の上昇によって証明されるように、低下した造血を非常に効果的に回復させました。臍帯血造血細胞移植後の再生効果の安定性により、治療過程を中断することなく放射線療法および化学療法を継続することが可能となりました。腫瘍血液学患者に対する臍帯血幹細胞の同種移植の有効性が高いという情報があり、同種骨髄移植を受けた患者における腫瘍疾患の年間再発リスクは、臍帯血幹細胞を用いた場合の25%に対し、同種骨髄移植を受けた患者では40%でした。
凍結保存された臍帯血幹細胞の作用機序は、新生児細胞が持つ造血成長因子の自己分泌産生能に起因する、レシピエントの造血に対する体液性刺激、およびドナー細胞の一時的な移植の結果（輸血後7～15日目におけるレシピエントの末梢血中の胎児ヘモグロビン含有量が初期データと比較して確実に増加していることが証拠）とみなされるべきである。臍帯血レシピエントにおいて輸血後反応が認められなかったのは、免疫担当細胞の相対的な耐性によるものであり、凍結保存された材料の生物学的妥当性に対する信頼性基準でもある。
臍帯血Tリンパ球キラー前駆細胞は、外因性サイトカイン刺激の影響下で活性化する能力を有しており、これを利用して、移植リンパ球成分の抗腫瘍細胞傷害活性を誘導し、その後の免疫療法に用いるための新たな体外および生体内手法を開発しています。さらに、臍帯血免疫担当細胞のゲノムの「未熟性」は、分子モデリング手法を用いて抗腫瘍活性を高めるために利用することができます。
今日、臍帯血は主に小児血液学において広く応用されています。急性白血病の小児患者において、臍帯血造血幹細胞の同種移植は、骨髄移植と比較して、移植片対宿主病の発生率を著しく低下させます。しかし、これは好中球減少症および血小板減少症の期間が長くなり、残念ながら移植後100日死亡率が上昇することを伴います。末梢血中の顆粒球および血小板数の回復に長期間を要する理由は、放射性ローダミンの吸収率の低さや細胞表面におけるCD38抗原の発現の低さから明らかなように、CD34陽性臍帯血細胞の個々のサブポピュレーションの分化が不十分であることに起因すると考えられます。
一方、適合する非血縁者骨髄ドナーが存在せず、かつ自家造血幹細胞の動員も不可能であったため、成人患者への臍帯血造血幹細胞移植が行われた結果、30歳未満の患者群では1年無再発生存率（73%）が高かった。移植患者の年齢範囲（18～46歳）を拡大すると、生存率は53%に低下した。
骨髄と臍帯血中の CD34+ 表現型の細胞を定量分析すると、骨髄の方がそれらの含有量が高い (3.5 倍) ことが明らかになりましたが、臍帯血では表現型プロファイル CD34+HLA-DR の細胞がかなり多く見られました。免疫マーカー CD34+HLA-DR を持つ血液細胞は免疫表現型 CD34+HLA-DR+ を持つ細胞よりも活発に増殖することが知られており、これは長期にわたる造血細胞培養の in vitro 実験研究で確認されました。CD34+CD38 表現型の原始的細胞前駆細胞は臍帯血と骨髄の両方に含まれていますが、マーカーセット CD34+CD38 を持つ臍帯血細胞は、成人ドナーの骨髄から分離された同じ表現型の造血細胞よりもクローン形成活性が高くなっています。さらに、CD34+CD38 免疫表現型を持つ臍帯血細胞は、サイトカイン刺激 (IL-3、IL-6、G-CSF) に反応してより速く増殖し、長期培養では骨髄細胞の 7 倍のコロニーを生成します。
臍帯血幹細胞バンク
臍帯血幹細胞移植という新たな実用医療分野を適切に発展させ、骨髄造血幹細胞移植を実施するためには、広範な血液バンクネットワークが必要です。これは既に米国と欧州で構築されています。国内の臍帯血バンクネットワークは、ネットコードバンク協会によって統合されています。国際的な臍帯血バンク協会を設立することが適切である理由は、非血縁者移植を行うには、HLAが一致するドナーを選択するために、大量の型別臍帯血サンプルが必要であるという事実にあります。様々なHLA型の血液サンプルを保管するバンクシステムを確立することによってのみ、必要なドナーを見つけるという問題を真に解決できます。このような臍帯血バンクシステムを構築するには、現在国際レベルで議論されている倫理的および法的規範の予備的な策定が必要です。
ウクライナで臍帯血バンクを設立するためには、一連の規制や文書を策定する必要がある。
まず第一に、臍帯血の採取、分画、凍結方法の標準化が課題となる。産科病院における臍帯血採取のルールを医療倫理の要求に沿って規定し、移植の成功を保証するための臍帯血の最小量を決定する必要がある。造血幹細胞の質と量を評価する様々な基準、HLAタイピング法、臍帯血細胞の輸血中に伝播する可能性のある遺伝性疾患や感染症の診断法を比較・標準化し、健康なドナーを選択するための共通基準を確立する必要がある。また、臍帯血から採取した血清、細胞、DNAを個別に保管する施設の設置についても検討する価値がある。
骨髄ドナー登録簿と連携するための臍帯血データのコンピュータネットワークを構築することが不可欠です。細胞移植学のさらなる発展のためには、HLA一致血縁者と非血縁者からの臍帯血移植および骨髄移植の結果を比較するための特別なプロトコルを開発する必要があります。両親へのインフォームド・コンセント、および児に発見された遺伝性疾患および／または感染症に関する母親または血縁者への通知を含む文書の標準化は、臍帯血細胞の臨床使用における倫理的および法的問題の解決に役立ちます。
ウクライナにおける細胞移植学の発展にとって決定的な条件となるのは、国家幹細胞提供プログラムの導入と、世界骨髄ドナー協会（WMDA）、米国国家骨髄ドナープログラム（NMDP）、その他の登録機関を通じた他国との国際協力の発展である。
臍帯血造血幹細胞移植の発展の歴史はまだ浅いが、1970年代初頭に提唱された臍帯血の臨床応用の可能性に関する最初の仮説が1980年代に動物実験の結果によって確認され、1988年には世界で初めて臍帯血造血細胞のヒトへの移植が行われ、その後、世界的な臍帯血バンクのネットワークが構築され始めた。10年間で、臍帯血造血細胞移植を受けた患者の数は800人に迫った。その中には、腫瘍性疾患（白血病、リンパ腫、固形腫瘍）や非腫瘍性疾患（先天性免疫不全症、貧血、代謝異常関連疾患）の患者が含まれていた。
臍帯血中の早期および分化誘導された前駆細胞は、成人の末梢血よりも多く含まれています。顆粒球-マクロファージコロニー形成単位の数とその増殖能に関しては、成長因子の添加後であっても、臍帯血は成人の末梢血をはるかに上回っています。in vitroでの長期細胞培養において、臍帯血細胞は骨髄細胞よりも高い増殖活性と生存率を示すことが確認されています。臍帯血幹細胞移植において重要な点は、有核細胞の数と造血能、サイトメガロウイルス感染の有無、ドナーとレシピエントのHLA適合性、患者の体重と年齢です。
しかしながら、臍帯血幹細胞移植は、主に小児における重篤な血液疾患の治療において、骨髄移植の代替療法として検討されるべきです。臍帯血細胞移植の臨床的課題は徐々に解決されつつあります。臍帯血細胞の採取、分離、凍結保存には非常に効果的な方法が既に確立されており、臍帯血バンクの形成のための条件も整い、有核細胞の検査方法も改善されています。バンク構築において臍帯血造血幹細胞を大量に調達する際には、3%ゼラチン溶液と6%ヒドロキシエチルデンプン溶液が分離に最適であると考えられます。
P. Perekhrestenkoら（2001）は、臍帯血幹細胞移植が、様々な原因による造血抑制を克服するための一連の治療法の中で、正当な位置を占めるべきであると正しく指摘しています。臍帯血幹細胞には、入手が比較的容易であること、ドナーにリスクがないこと、新生児細胞のウイルス汚染が低いこと、そして移植費用が比較的低いことなど、多くの重要な利点があるためです。一部の著者は、臍帯血細胞移植では骨髄細胞移植よりも移植片対宿主反応に関連する合併症が少ないと指摘しています。これは、臍帯血細胞上のHLA-DR抗原の発現が弱く、未熟であることが原因であると考えています。しかし、臍帯血中の核細胞の主な集団は T リンパ球 (CD3 陽性細胞) であり、その含有量は約 50% で、成人の末梢血よりも 20% 少ないですが、これらの供給源からの T 細胞サブ集団の表現型の違いは重要ではありません。
臍帯血幹細胞移植の生存率に直接影響を与える要因としては、患者の年齢（1歳から5歳のレシピエントで最も良好な結果が得られる）、疾患の早期診断、そして白血病の形態（急性白血病では有効性が著しく高い）が挙げられます。特に重要なのは、有核臍帯血細胞の投与量と、レシピエントとのHLA適合性です。腫瘍血液学における臍帯血造血幹細胞移植の臨床的有効性に関する分析において、血縁者間移植が最も良好な治療結果を示しているのは偶然ではありません。血縁者間移植の場合、無再発生存率1年は63%に達するのに対し、非血縁者間移植ではわずか29%です。
このように、臍帯血には多数の幹細胞が存在し、新生児造血幹細胞は再生能力が高いため、腫瘍性血液疾患患者における同種移植に使用することができます。ただし、臍帯血造血細胞移植後の造血の再開には「時間がかかる」ことに注意する必要があります。末梢血中の好中球含有量の回復は通常6週目までに観察され、血小板減少症は通常6か月後に消失します。さらに、臍帯血造血細胞が未熟であるからといって、免疫学的衝突が排除されるわけではありません。重度の急性および慢性の移植片対宿主病は、それぞれレシピエントの23%と25%に観察されます。臍帯血細胞移植後1年以内に急性白血病が再発した症例は、26%に認められます。