変形性関節症の実験モデル
最後に見直したもの： 07.07.2025
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軟骨は高度に特殊化した組織であり、1種類の細胞（軟骨細胞）のみで構成され、血管やリンパ管が存在しないのが特徴です。軟骨は主に滑液からの吸収によって栄養を得ます。軟骨細胞の代謝は、軟骨細胞と周囲の組織によって局所的に産生されるいくつかの可溶性因子によって制御されます。軟骨細胞の機能は、細胞外環境の組成（酸素圧、イオン濃度、pHなど）、ECMの組成、細胞とマトリックスの相互作用、および物理的シグナルにも依存します。実験モデリングの主な目的は、成熟細胞の表現型を変化させることなく、細胞外環境で培養物を作成することです。2つ目の目的は、化学的および/または物理的シグナルに対する軟骨細胞の時期尚早、遅延、短期的、または長期的反応を研究するための培養物を作成することです。in vitro研究は、変形性関節症における軟骨細胞の挙動を研究する機会も提供します。 3つ目の目標は、関節における様々な組織の相互作用を研究できる共培養システムの開発です。4つ目の目標は、移植のための軟骨インプラントの作製です。そして最後に、5つ目の目標は、修復を促進したり、軟骨吸収を抑制したりする能力を持つ成長因子、サイトカイン、または治療薬の研究です。
過去数十年にわたり、関節軟骨細胞培養の様々なモデルが開発されてきました。これには単層培養、懸濁培養、軟骨培養、組織片、共培養、不死化細胞培養などが含まれます。それぞれの培養には長所と短所があり、それぞれが軟骨細胞代謝の特定の側面を研究するのに適しています。したがって、軟骨組織片は、真の細胞表面受容体と正常な細胞-マトリックスおよびマトリックス-細胞相互作用を必要とするマトリックス要素のターンオーバーを研究するための優れたモデルです。同時に、単離細胞の培養において、マトリックス沈着物や軟骨細胞代謝を制御するメカニズムを研究することが推奨されます。細胞分化のプロセスを研究するには、低密度単層培養が必要です。天然または合成マトリックスに懸濁した培養は、機械的ストレスに対する軟骨細胞の適応応答を分析するためのモデルです。
軟骨細胞培養
In vitro 研究のための軟骨組織を選択する際には、いくつかの重要な点を考慮に入れる必要があります。軟骨細胞のマトリックス構成と代謝活性は関節間で異なり、後者は組織内の軟骨細胞の位置の深さにも依存します。これらのデータは、異なる深さの軟骨領域から単離された軟骨細胞サブポピュレーションを研究したいくつかの実験で得られました。関節軟骨の表層と深層に位置する培養軟骨細胞の間には、多くの形態学的および生化学的差異が見つかりました。表層の細胞はプロテオグリカンの少ないまばらな線維状マトリックスを合成するのに対し、深層細胞は線維とプロテオグリカンに富むマトリックスを生成します。さらに、表層細胞は深層軟骨細胞よりも、比較的多くの小型の非凝集プロテオグリカンとヒアルロン酸を生成し、比較的少ないアグリカンとケラタン硫酸を生成します。異なる深さの軟骨層から単離された軟骨細胞の代謝におけるもう一つの重要な特徴は、外因性刺激に対する応答である。M. Aydelotteらによると、ウシ軟骨の表層部由来の軟骨細胞は、深層部由来の細胞よりもIL-1に対する感受性が高かった。
細胞の挙動は組織の場所によっても異なります。同じ動物の肋骨軟骨と耳軟骨の軟骨細胞は、線維芽細胞増殖因子 (FGF) や TGF-β などの成長因子に対して異なる反応を示します。FGF は培養された肋骨へのチミジン、プロリン、ロイシンの取り込みを増加させましたが、耳軟骨細胞への取り込みは増加させませんでした。TGF-β は肋骨軟骨と耳軟骨の軟骨細胞へのチミジンの取り込みを増加させましたが、耳軟骨細胞へのチミジンとプロリンの取り込みには影響を及ぼしませんでした。軟骨への高ストレス領域の軟骨細胞は、低ストレス領域の軟骨細胞とは異なります。そのため、生体内で最大の負荷がかかる半月板で覆われていない脛骨関節面の中央領域から採取した成熟ヒツジ膝関節軟骨の軟骨細胞は、半月板で覆われた領域の細胞よりもアグリカンの合成量が少なく、デコリンの合成量が多くなります。著者らはまた、関節の総合的な機能を研究する際には同一の関節領域からの軟骨を使用することの重要性を強調している。
軟骨細胞の代謝と調節因子に対する反応は、ドナーの年齢、骨格の発達、および細胞が採取された関節の状態に大きく依存します。ヒト軟骨細胞では、加齢とともに増殖反応の大幅な低下が観察されています。最も大きな低下は、40〜50歳と60歳以上のドナーで観察されています。さらに、成長因子（FGF、TGF-βなど）に対する増殖反応の重症度は、加齢とともに低下します。軟骨細胞の増殖における量的変化に加えて、質的変化もあります。若いドナー（10〜20歳）の細胞は、TGF-βよりも血小板由来成長因子（PDGF）によく反応しますが、成人ドナーの細胞ではその逆が観察されます。軟骨細胞の合成機能と成長因子に対する反応における加齢依存的な変化を説明するために、いくつかのメカニズムが用いられています。これらには、表面細胞受容体の数と親和性の減少、成長因子とサイトカインの合成と生物活性の変化、受容体後シグナルの修正が含まれます。
関節の病態は、軟骨細胞の形態と代謝活性にも変化をもたらします。例えば、J. Kouri ら (1996) は、変形性関節症の軟骨において、軟骨細胞を3つのサブポピュレーションに分類しました。軟骨の表層部および中央上部の軟骨細胞はクラスターを形成し、プロテオグリカンとコラーゲンをより多く合成します。TGF-βとインスリン様成長因子 (IGF) は、軟骨細胞によるプロテオグリカンの合成を刺激し、IL-1とTNF-αの作用を部分的に中和します。変形性関節症に罹患した軟骨の組織片および変形性関節症患者の軟骨から単離された軟骨細胞は、健常軟骨の軟骨細胞よりもTGF-βの刺激に対して感受性が高いことが報告されています。これらの違いは、関節軟骨の上層にある軟骨細胞の表現型の変化に関連している可能性が高いと考えられます。
個々の軟骨細胞は、細胞外マトリックス（ECM）をタンパク質分解酵素で順次処理することで分離されます。ECMから遊離した細胞は、マトリックス成分のde novo合成を研究するのに最適です。クロストリジウムコラーゲナーゼのみを使用する研究者もいれば、トリプシン、プロナーゼ、DNase、ヒアルロニダーゼのいずれか、または複数を添加して軟骨をプレインキュベートする研究者もいます。分離される細胞の数は使用する酵素によって異なります。例えば、コラーゲナーゼのみで処理した場合、組織1gから1.4 ～10 6個の軟骨細胞が得られますが、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コラーゲナーゼを同時に処理した場合は4.3～106個になります。コラーゲナーゼで処理した場合、アグリカン、タンパク質、IL-6、IL-8は、異なる酵素で順次処理した場合よりも、細胞培養物中に有意に多く残ります。2つの細胞培養物間のこれらの違いには、いくつかの説明が考えられます。
- 細胞受容体は酵素によって損傷または阻害を受け、新鮮単離軟骨細胞（1日目）ではTGF-βがDNAおよびプロテオグリカンの合成を阻害するのに対し、単層培養された軟骨細胞（7日目）ではDNAおよびプロテオグリカンの合成はTGF-βによって刺激される。しかし、実験開始前にこれらの膜成分を再発現させるには十分な期間が必要である。
- 外因性プロテアーゼは、インテグリンを介した細胞-マトリックス相互作用を阻害する可能性があります。インテグリンファミリーは、軟骨細胞のECM分子への接着を促進します（Shakibaei M. et al., 1997）。この阻害は、マトリックス遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性があります。
- マトリックス成分の残留物は、軟骨細胞の合成機能を調節することができる。インテグリンは ECM 分解産物を認識することができるため、タンパク質分解酵素の作用後の組織修復に重要な役割を果たす。T. Larsson ら (1989) は、細胞培養に完全または断片化されたプロテオグリカンを添加すると、タンパク質およびプロテオグリカンの合成が刺激されることを報告した。しかし、ヒアルロン酸のレベルが高いと、ニワトリ胚の軟骨細胞、ブタの成熟軟骨細胞、およびラットの軟骨肉腫細胞によるプロテオグリカンの合成における硫酸塩の包含が大幅に減少する。さらに、ヒアルロン酸は、IL-1β、TNF-α、FGF の存在下でも細胞からのプロテオグリカンの放出を阻害し、これは成長因子およびサイトカインの最初の生物学的活性を阻害することを示す。ヒアルロン酸の作用の正確なメカニズムは不明である。軟骨細胞は、細胞質のアクチンフィラメントに結合したヒアルロン酸受容体を有することが知られています。ヒアルロン酸がその受容体に結合すると、タンパク質のリン酸化が促進されます。したがって、これらのデータは、マトリックスタンパク質の断片化分子または天然分子が細胞膜受容体を活性化することにより、軟骨細胞の代謝機能を調節することを示しています。
- 酵素による軟骨細胞でのマトリックスタンパク質合成の急速な刺激は、軟骨細胞の形状の変化および/または細胞骨格の再編成の結果である可能性があります。
- 一部のサイトカイン（例：IL-8）や成長因子（例：IGF-1、TGF-β）はECMに隔離されています。最もよく知られている例は、デコリンがTGF-βに結合することで、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるTGF-βの細胞増殖誘導能が低下することです。軟骨中のデコリン含量が加齢とともに増加するという知見は、加齢とともにTGF-βのバイオアベイラビリティが低下することを示唆しています。成長因子やサイトカインは培養中にマトリックスデブリスから放出され、その後軟骨細胞の機能を調節する可能性があります。
軟骨細胞の単層培養
軟骨細胞の分化表現型は、主にII型コラーゲンおよび組織特異的プロテオグリカンの合成、ならびに低レベルの有糸分裂活性によって特徴付けられる。単層での長期細胞培養および数回の細胞継代を繰り返すと、軟骨細胞は球状の輪郭を失い、細長い線維芽細胞のような形状を獲得するという証拠がある。このような線維芽細胞性化生では、細胞の合成機能も変化し、II型、IX型、XI型コラーゲンの合成が徐々に減少し、I型、III型、Y型コラーゲンの合成が増加するという特徴がある。機能的なアグリカンにより、小さな非凝集プロテオグリカンが合成される。カテプシンBおよびLの合成は分化細胞では非常に低いが、分化の喪失の過程で増加する。コラーゲナーゼ-1は分化した軟骨細胞で発現される。培養期間が長くなるとその発現は減少し、メタロプロテアーゼの組織阻害剤 (TIMP) の産生が増加します。
分化軟骨細胞は、単層培養から懸濁培養に移されると、分化表現型のコラーゲンを再発現します。分化プロセスはおそらく細胞の形状に関連しており、この特性は、自家軟骨細胞を用いた欠損移植片の研究において研究者によって頻繁に利用されています。生検材料から採取した少量の細胞は、単層培養で増殖させ、移植前に三次元マトリックスに再導入することができます。アガロース培養に移された脱分化軟骨細胞による特定の表現型の再発現は、TGF-β、オセイン-ヒドロキシアパタイト複合体、およびアスコルビン酸によって刺激されます。
軟骨細胞は分化過程において、成長因子およびサイトカインに反応して変化します。サイトカインおよび成長因子に対する細胞応答は、未分化軟骨細胞と分化軟骨細胞で異なります。IL-1は線維芽細胞の増殖を刺激しますが、未分化軟骨細胞の増殖はIL-1によって阻害されます。伸長軟骨細胞ではIGF-1によってDNA合成が刺激されますが、扁平化した軟骨細胞では刺激されません。分化軟骨細胞では、IL-1βおよびTNF-αによるプロコラーゲナーゼ産生への刺激効果は、未分化軟骨細胞よりも顕著です。
軟骨細胞培養
軟骨細胞を液体培地、あるいは天然または合成の三次元マトリックス中で懸濁培養すると、軟骨細胞の表現型が安定化します。細胞は球形を維持し、組織特異的なタンパク質を合成します。軟骨細胞の懸濁培養は、通常、新しい細胞周囲マトリックスの形成を研究するために推奨されます。合成または天然の吸収性ポリマー中での軟骨細胞の培養は、軟骨欠損部への細胞移植に用いられ、関節軟骨組織の再生を促進します。細胞移植用の合成または天然培地は、以下のいくつかの要件を満たす必要があります。
- インプラントは細胞の接着と成長のために多孔質構造を持たなければならない。
- ポリマー自体もその分解生成物も、体内に埋め込まれた場合、炎症や毒性反応を引き起こすことはない。
- 移植キャリアは隣接する軟骨または軟骨下骨に結合する能力を持たなければならない。
- 天然または合成マトリックスは吸収能力を持たなければならず、その分解は組織再生によってバランスが取れていなければならない。
- 軟骨の修復を促進するためには、マトリックスの化学構造と細孔構造が、そこに置かれた軟骨細胞による細胞表現型の維持と組織特異的タンパク質の合成を促進する必要がある。
- 生体内移植時には、合成または天然マトリックスの機械的特性を研究する必要があります。
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液相中の軟骨細胞の懸濁液
軟骨細胞を培養するプラスチック容器への細胞の付着は、容器の壁をメチルセルロース、アガロース、ハイドロゲル（ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはコラーゲン-アガロース混合物でコーティングすることで防ぐことができます。これらの条件下では、軟骨細胞はクラスターを形成し、主にアグリカンと組織特異的コラーゲン（II型、IX型、XI型）を合成します。通常、2種類の細胞が存在します。中心に位置する細胞は球形を維持し、組織化学および超微細構造研究によって確認されるように、十分に発達した細胞外マトリックス（ECM）に囲まれています。周縁部では、軟骨細胞は円盤状の輪郭を持ち、まばらなECMに囲まれています。このような細胞の機能特性についてはほとんど分かっていません。
軟骨細胞は、浮遊状態にあるマイクロキャリア上で培養することが可能です。マイクロキャリアとしては、デキストランビーズ（サイトデックス）、コラーゲンコーティングデキストランビーズ（サイトデックスIII）、非多孔性I型コラーゲンマイクロスフィア（セラゲン）などが用いられます。これらの培養条件下では、軟骨細胞はマイクロキャリア表面に接着し、球状を維持し、マトリックス様物質を形成します。さらに、セラゲンの使用は軟骨細胞の増殖と正常な表現型の再発現を促進します。したがって、セラゲンマイクロスフィア上で軟骨細胞を培養することで、移植前に細胞表現型を回復させることができます。
軟骨細胞懸濁液を液体培地で培養するもう一つの方法は、遠心分離によって得られた細胞（0.5～1×10 b）からなる高密度ボールの形で培養することです。このような軟骨細胞は、プロテオグリカンとII型コラーゲンを多く含む基質を産生しますが、I型コラーゲンは産生しません。これは組織学的、免疫組織学的、定量的手法によって確認されています。
天然ECM中の軟骨細胞の懸濁液
軟骨細胞は、三次元マトリックス（軟寒天、アガロース、コラーゲンゲルまたはスポンジ、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、アルギン酸ビーズ）内で懸濁液として培養できます。
アガロースで培養された軟骨細胞は、正常な表現型を保持し、II型コラーゲンと組織特異的なアグリカン凝集体を合成します。アガロースで培養すると、細胞によって合成されたプロテオグリカンが50日間培地に放出されます。比較すると、単層培養では、培養開始5～6日目ですでに細胞相がグリコサミノグリカンで満たされます。培地で培養すると、最初の8～10日間でグリコサミノグリカンの合成と放出が増加した後、時間依存的に減少します。しかし、アガロースで培養した場合の軟骨細胞の挙動は、生体内の挙動とは異なります。アガロースでは、合成されたアグリカン凝集体の多くは、生体内よりも分子が小さく、分子数も少ないです。TGF-βは組織切片でのプロテオグリカン合成を刺激しますが、アガロースでのアグリカン合成を抑制します。
アルギン酸は褐藻から得られる線状多糖類です。Ca 2+ イオンなどの二価陽イオンの存在下では、このポリマーはゲル化します。アルギン酸に閉じ込められた各軟骨細胞は、負に帯電した多糖類のマトリックスに囲まれており、その細孔は硝子軟骨の細孔に匹敵します。アルギン酸ビーズ内の軟骨細胞によって形成されるマトリックスは、2つのコンパートメントで構成されています。1つは細胞関連マトリックスの薄層で、関節軟骨の細胞周囲および領域マトリックスに相当し、もう1つはより離れた、天然組織の領域間マトリックスに相当するマトリックスです。培養30日目には、アルギン酸ビーズ内の細胞と2つのコンパートメントのそれぞれが占める相対的および絶対的な体積は、天然軟骨のものとほぼ完全に同一になります。軟骨細胞はほぼ30日間球形を維持し、関節軟骨マトリックス中のアグリカン分子と同様の流体力学的特性を持つアグリカン、ならびにII型、IX型、XI型コラーゲン分子を産生します。同時に、他の懸濁培養と同様に、アルギン酸ビーズの表面には扁平化した細胞が存在し、少量のI型コラーゲン分子を産生します。これらのI型コラーゲン分子は培地に直接放出され、ECMには取り込まれません。アルギン酸ビーズでは、軟骨細胞の適度な増殖が観察されます。アルギン酸ゲル中で8ヶ月間培養した後も、成熟した軟骨細胞は代謝活性を失わず、組織特異的なII型コラーゲンとアグリカンの合成を継続します。
H. 田中ら (1984) は、アルギン酸中の様々な天然分子の拡散特性を調査し、70 kDaを超える分子はアルギン酸を透過しないことを明らかにしました。したがって、アルギン酸中での細胞培養は、マトリックス生合成および細胞外マトリックス（ECM）の組織化の制御を研究するのに適しています。アルギン酸中で培養された細胞が利用可能であることから、ペプチド制御因子や薬理学的薬剤の作用を転写、転写後、翻訳レベルで研究することが可能になります。
軟骨細胞は、I型およびII型のコラーゲン繊維のマトリックスでも培養されます。S. Nehrerら (1997) は、異なるタイプのコラーゲンを含む多孔質コラーゲン-プロテオグリカンポリマーマトリックスにおけるイヌ軟骨細胞の機能を比較しました。彼らは、I型およびII型コラーゲンを含むコラーゲンマトリックスで培養された軟骨細胞の生合成機能の形態に重要な違いがあることを発見しました。II型コラーゲンマトリックス内の細胞は球形を維持しましたが、I型コラーゲンでは線維芽細胞様の形態を示しました。さらに、II型コラーゲンマトリックスでは、軟骨細胞はより多くのグリコサミノグリカンを産生しました。J. van Susanteら (1995) は、アルギン酸ゲルとI型コラーゲンゲルで培養された軟骨細胞の特性を比較しました。著者らは、コラーゲンゲル中の細胞数が著しく増加したことを確認したが、培養6日目から細胞は特徴的な表現型を失い、線維芽細胞様細胞へと変化した。アルギン酸ゲルでは細胞数の減少が観察されたが、軟骨細胞は正常な表現型を維持した。コラーゲンゲルでは、細胞あたりのプロテオグリカン数はアルギン酸ゲルよりも有意に高かったが、コラーゲンゲルでは培養6日目からマトリックス成分の合成が減少したのに対し、アルギン酸ゲルでは合成が増加し続けた。
固体の三次元フィブリンマトリックスは、分化した表現型においてその中に浮遊する軟骨細胞を支える天然物質です。三次元フィブリンマトリックスは、軟骨細胞移植におけるキャリアとしても使用できます。フィブリンの利点は、細胞毒性がないこと、空間充填能、接着能です。組織学的および生化学的研究、オートラジオグラフィー、電子顕微鏡観察により、フィブリンゲル中の軟骨細胞は培養2週間後でも形態を維持し、増殖し、マトリックスを産生することが示されています。しかし、G. Hommingaら (1993) は、培養3日後からフィブリンの崩壊が始まり、軟骨細胞の脱分化が進行することを報告しています。
人工（合成）ECM中の軟骨細胞の懸濁液
再建手術や整形外科手術用の軟骨インプラントは、単離した軟骨細胞を生体外合成適合性マトリックス内で培養することによって得ることができます。
ポリグリコール酸中で培養された軟骨細胞は増殖し、8週間にわたり正常な形態と表現型を維持します。軟骨細胞-ポリグリコール酸複合体は、細胞、グリコサミノグリカン、コラーゲンから構成され、外側にコラーゲン被膜を有しています。しかし、このようなインプラントにはI型とII型の2種類のコラーゲン分子が含まれています。一連の継代培養によって脱分化させた軟骨細胞由来のインプラントは、主に未分化の軟骨細胞由来のインプラントよりもグリコサミノグリカンとコラーゲンの量が多くなります。
L. Freed ら (1993b) は、繊維状ポリグリコール酸 (FPGA) と多孔質ポリ乳酸 (PPLA) におけるヒトおよびウシ軟骨細胞培養の挙動を比較しました。FPGA または PPLA でウシ軟骨細胞を 6 ～ 8 週間培養した後、著者らは細胞増殖と軟骨マトリックスの再生を観察しました。FPGA では、軟骨細胞は球形をしており、軟骨マトリックスに囲まれた小腔に位置していました。8 週間の in vitro 培養後、再生組織には最大 50% の乾燥物質 (細胞塊 4%、グリコサミノグリカン 15%、コラーゲン 31%) が含まれていました。PPLA では、細胞は紡錘形をしており、グリコサミノグリカンとコラーゲンの量はわずかでした。FPGA では、細胞増殖は PPLA よりも 2 倍活発でした。生体内では、VPGKおよびPPLCで培養された軟骨細胞は、1～6ヶ月以内に組織学的に軟骨に類似した組織を生成した。インプラントにはグリコサミノグリカン、I型コラーゲン、II型コラーゲンが含まれていた。
ウシ胎児軟骨細胞を、多孔質高密度疎水性ポリエチレンおよび親水性ポリエチレンで培養した。両基質で7日間培養後、細胞は球状を維持し、主にII型コラーゲンを含有していた。21日間培養後、親水性基質には疎水性基質よりも多くのII型コラーゲンが含まれていることがわかった。
軟骨組織は、ミリセルCMフィルター上で単層培養することによっても得ることができます。フィルターをコラーゲンで前処理することは、コンドロイチンの付着に必要です。培養物の組織学的検査では、プロテオグリカンとII型コラーゲンを含む細胞外マトリックス（ECM）中に軟骨細胞が蓄積していることが確認されました。この培養ではI型コラーゲンは検出されませんでした。得られた軟骨組織中の軟骨細胞は球状ですが、組織表面ではやや扁平化しています。新しく形成された組織の厚さは時間の経過とともに増加し、細胞単層の初期密度に依存していました。最適な培養条件下では、軟骨組織の厚さは110μmに達し、細胞とコラーゲンの表層および深層への配置は関節軟骨と同様でした。ECMには、約3倍のコラーゲンとプロテオグリカンが含まれています。培養2週間後、マトリックスの蓄積が観察され、フィルターから組織を抽出して移植に使用することが可能になりました。
Simsら（1996）は、ポリエチレンオキシドゲル（注入によって大量の細胞を移植することを可能にするカプセル化されたポリマーマトリックス）における軟骨細胞の培養を研究した。無胸腺マウスの皮下組織に注入してから6週間後、新たな軟骨が形成され、形態学的には硝子軟骨に類似した白色乳白色を呈していた。組織学的および生化学的データは、活発に増殖し、ECMを産生する軟骨細胞の存在を示した。
摘出
軟骨組織の外植は、その中の同化および異化、恒常性の維持、吸収および修復のプロセスを研究するために使用されます。軟骨外植片内の軟骨細胞は、生体内の関節軟骨と同様の正常な表現型とECM組成を維持します。血清存在下で5日間培養すると、一定レベルの合成および自然分解プロセスが達成されます。組織の吸収は、主培養および血清添加培養で、IL-IB、TNF-α、細菌性リポ多糖、レチノイン酸誘導体、活性酸素ラジカルなどのいくつかの因子を使用して促進できます。軟骨修復を研究するために、可溶性炎症メディエーター（H 2 O 2、IL-1、TNF-α）またはマトリックスの物理的破壊によって軟骨損傷を誘発します。
器官培養法は、単独の外部因子が軟骨細胞および周囲の細胞外マトリックスに及ぼす影響をin vitroで研究するためのモデルです。in vivoでは、軟骨細胞はECM中にまばらに存在し、互いに接触していません。関節軟骨組織片培養では、この構造的構成に加え、軟骨細胞と周囲の細胞外環境との特異的な相互作用が保存されます。このモデルは、機械的ストレス、薬剤、成長因子、サイトカイン、ホルモンが軟骨代謝に及ぼす影響の研究にも用いられます。
軟骨組織移植のもう一つの利点は、細胞を単離する際に避けられないタンパク質分解酵素や機械的因子による軟骨細胞への損傷がないことです。受容体やその他の膜タンパク質、糖タンパク質は、損傷因子から保護されます。
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コンドロン培養
軟骨は、関節軟骨の構造的、機能的、および代謝的な単位であり、軟骨細胞、その細胞周囲基質、そして緻密な糸状被膜から構成され、基質の恒常性を担っています。軟骨は機械的に軟骨から抽出され、低速ホモジナイズを複数回繰り返して収集されます。軟骨の深さの異なる部位から分離された軟骨は、単一軟骨、対型軟骨、複数（3つ以上）の線状配列軟骨（軟骨柱）、および軟骨クラスターの4つのカテゴリーに分類されます。
単独のコンドロンは通常、損傷のない軟骨の中間層に見られ、対になったコンドロンは中間層と深層の境界に見られ、線状に配置された複数のコンドロンは損傷のない軟骨の深層に典型的に見られます。最後に、コンドロンクラスターは、単独および対になったコンドロンのランダムに組織化されたグループで構成され、均質化後も凝集状態を維持します。コンドロンクラスターは軟骨の大きな断片で、通常、いくつかのコンドロンと放射状に配置されたコラーゲン原線維、つまりマトリックスの深層の典型的な組織特性を含みます。コンドロンは透明なアガロースに固定化されているため、その構造、分子組成、および代謝活動を研究できます。コンドロン-アガロースシステムは軟骨のミクロモデルと考えられており、従来の軟骨細胞-アガロースシステムとは異なり、自然の微小環境が保存されているため、合成して組み立てる必要はありません。軟骨培養は、正常および病的な条件下での関節軟骨の細胞と基質の相互作用を研究するためのモデルです。
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不死化軟骨細胞の培養
細胞を「不死化」させる組換えDNAまたは癌遺伝子を含むウイルスは、永久細胞株の作製に用いられる。不死化軟骨細胞は、安定した表現型を維持しながら無限に増殖する能力を有する。F. Mallein-Gerinら（1995）は、SV40T癌遺伝子がマウス軟骨細胞の増殖を誘導し、II型、IX型、XI型コラーゲン、そして関節アグリカンと結合タンパク質を安定的に発現し続けることを示した。しかし、このような細胞株は単層培養またはアガロースゲル中で培養すると、I型コラーゲンを合成する能力を獲得する。
W. Hortonら（1988）は、II型コラーゲンmRNAの発現レベルが低い不死化細胞株を報告した。これらの細胞は、I-myc-およびy-ra-オンコゲンを含むマウスレトロウイルスによる形質転換によって得られた。この細胞は、II型コラーゲン非存在下における関節マトリックスの相互作用、ならびにII型コラーゲンの合成制御を研究するための独自のモデルとなる。
変異または欠失遺伝子を持つ軟骨細胞培養は、その生理学的機能の研究に便利なモデルです。このモデルは、軟骨マトリックスの組織化における特定分子の役割の研究や、軟骨代謝に対するさまざまな調節因子の効果の調査に特に適しています。IX型コラーゲンの遺伝子を欠失した軟骨細胞は、通常よりも幅の広いコラーゲン原線維を合成することから、IX型コラーゲンが原線維の直径を調節していることがわかります。第1章で述べたように、II型コラーゲンをコードするCOLAI遺伝子の変異が、最近、一次性全身性変形性関節症の家系で発見されました。変異II型コラーゲンが関節マトリックスに及ぼす影響を研究するため、R. Dharmrvaramら (1997) は、欠陥のあるCOL 2 AI (位置519のアルギニンがシステインに置換) をin vitroでヒト胎児軟骨細胞にトランスフェクト (外来核酸を感染) しました。
共培養システム。関節において、軟骨は滑膜、滑液、靭帯、そして軟骨下骨に含まれる他の種類の細胞と相互作用します。軟骨細胞の代謝は、これらの細胞によって合成される様々な可溶性因子の影響を受ける可能性があります。例えば、関節炎においては、関節軟骨は滑膜細胞によって産生されるタンパク質分解酵素とフリーラジカルによって破壊されます。そのため、軟骨と周囲組織との複雑な相互作用を研究するためのモデルが開発されており、これらは共培養と呼ばれます。
S. Lacombe-Gleiseら（1995）は、ウサギ軟骨細胞と骨芽細胞を共培養システム（COSTAR）で培養しました。このシステムでは、細胞は0.4μmの微多孔膜で隔てられており、2種類の細胞間の直接接触なしに細胞交換が可能でした。この研究は、骨芽細胞が可溶性メディエーターを介して軟骨細胞の成長を促進する能力を実証しました。
AM Malfaitら（1994）は、末梢血単球と軟骨細胞の関係を研究した。このモデルは、炎症性関節炎（関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎など）におけるサイトカイン介在性プロセスの研究に有用である。このモデルの著者らは、細胞を直径0.4μmの孔を持つタンパク質結合膜で分離した。この研究では、リポ多糖類で刺激された単球がIL-1およびTNF-αを産生し、それらが軟骨細胞によるアグリカンの合成を阻害し、既に合成されたアグリカン凝集体の分解に寄与することが示された。
K. Tadaら（1994）は、コラーゲン（I型）ゲル中の内皮細胞を、孔径0.4 μmのフィルターで軟骨細胞が入った外チャンバーから隔離された内チャンバーに置く共培養モデルを作成した。外チャンバーから完全に隔離された状態で、ヒト内皮細胞はEGFまたはTGF-α存在下でコラーゲンゲル中でチューブを形成した。両タイプの細胞を同時に培養すると、内皮細胞によるTGF-α依存性のチューブ形成は阻害された。軟骨細胞によるこのプロセスの阻害は、抗TGF-β抗体によって部分的に解除された。軟骨細胞によって産生されたTGF-βが、軟骨自体の血管新生を阻害していると考えられる。
S. Grootら（1994）は、16日齢のマウス胎児の骨肥大・増殖帯から採取した軟骨細胞を脳組織片と同時に培養した。培養4日後、軟骨細胞の骨芽細胞への分化転換と類骨形成の開始が観察された。培養11日後には、軟骨の一部が骨組織に置換され、骨基質は部分的に石灰化した。脳組織で産生される神経ペプチドや神経伝達物質の中には、骨芽細胞の代謝に影響を与えたり、それらの受容体を持つものがある。その中には、ノルエピネフリン、血管作動性腸管ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、サブスタンスP、ソマトスタチンなどがある。軟骨細胞と一緒に培養された脳組織片は、軟骨細胞から骨芽細胞への分化転換のプロセスを誘導することができる、列挙された因子のいくつかを生成することができます。
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軟骨細胞培養に対する外的因子の影響
軟骨細胞の代謝に対する酸素分圧の影響
ほとんどの場合、軟骨細胞培養は大気の酸素分圧の条件下で発達します。しかし、生体内の軟骨細胞は低酸素状態に存在し、さまざまな病態下で酸素分圧が変化することがよく知られています。成熟過程では、骨端への血液供給に大きな変化が見られます。血管新生は成長板のさまざまな領域で異なるため、それらの酸素分圧も異なります。C. BrightonとR. Heppenstall（1971）は、ウサギの脛骨板において、肥大領域の酸素分圧が周囲の軟骨よりも低いことを実証しました。いくつかの代謝パラメータの測定により、軟骨細胞は局所的な酸素濃度の変化に迅速に対応できることが示されました。まず、酸素分圧が低いと、軟骨細胞による酸素消費量は減少します。酸素分圧が21％から0.04％に低下すると、グルコース利用が増加し、解糖酵素の活性と乳酸の合成が増加します。低酸素圧下でも、ATP、ADP、AMPの絶対量は安定しています。これらのデータは、軟骨細胞の代謝が最大限のエネルギー節約を目的としていることを示唆しています。しかしながら、低酸素条件下では合成活性、ひいては修復プロセスが変化することが示唆されています。
高酸素分圧は軟骨細胞の代謝にも影響を与え、プロテオグリカンとDNAの合成低下、軟骨基質の分解を引き起こします。これらの影響は通常、遊離酸素ラジカルの生成を伴います。
環境中のイオン濃度と浸透圧が軟骨細胞機能に及ぼす影響
天然軟骨では、イオン濃度が他の組織とは大きく異なります。細胞外培地中のナトリウム含有量は250～350mmol、浸透圧は350～450mosmolです。軟骨細胞をECMから分離し、標準培地（DMEM（ダルベッコ最小必須培地）、浸透圧は250～280.7mosmol）で培養すると、細胞を取り巻く環境は劇的に変化します。さらに、標準培地中のカルシウムとカリウムの濃度は天然組織よりも著しく低く、陰イオン濃度は著しく高くなります。
培地にスクロースを添加すると浸透圧が上昇し、細胞質中のH +およびカルシウム陰イオンの濃度が一時的に増加します。このような細胞内変化は、軟骨細胞の分化プロセスや代謝活性に影響を及ぼす可能性があります。J. Urban ら (1993) は、単離軟骨細胞を標準DMEMで2～4時間培養したところ、 35 8-硫酸塩および3 H-プロリンの取り込みは、天然組織のわずか10%に過ぎないことを発見しました。合成の強度は、単離したばかりの軟骨細胞と軟骨組織切片の両方において、細胞外培地の浸透圧が350～400 mosmolのときに最大に達しました。さらに、単離細胞を特定の浸透圧の標準DMEMに置くと、軟骨細胞の体積が30～40%増加しました。しかし、軟骨細胞を非生理的浸透圧の条件下で 12 ～ 16 時間培養すると、細胞は新しい条件に適応し、細胞外環境の浸透圧の変化に比例して生合成の強度が低下します。
P. Borgettiら (1995) は、細胞外培地の浸透圧がブタ軟骨細胞の成長、形態、生合成に及ぼす影響について研究しました。著者らは、浸透圧0.28および0.38 mosmolの培地で培養した軟骨細胞に同様の生化学的および形態学的特徴が見られることを実証しました。培地の浸透圧0.48 mosmolでは、培養開始から4～6時間で細胞増殖およびタンパク質合成の減少が見られましたが、その後これらのパラメータは回復し、最終的にコントロール値に達しました。軟骨細胞を浸透圧0.58 mosmolの培地で培養すると、細胞は増殖過程の生理的強度を維持する能力を失い、6日後には軟骨細胞数が大幅に減少しました。培地の浸透圧0.58 mosmolでは、タンパク質合成の大幅な阻害が見られました。さらに、浸透圧0.28～0.38 mOsmの培地で培養した場合、軟骨細胞は生理学的表現型を維持する。一方、高浸透圧（0.48～0.58 mOsm）では、細胞形態に顕著な変化が見られ、特徴的な表現型の消失、軟骨細胞の線維芽細胞様細胞への転換、そして細胞がマトリックスプロテオグリカンを組み立てる能力の喪失といった形で現れる。本研究の結果は、軟骨細胞が細胞外環境における浸透圧の限られた変動に反応する能力を有していることを示している。
他のイオンの濃度の変化も、軟骨細胞における生合成プロセスに影響を及ぼす可能性があります。例えば、カリウムイオン濃度が5 mmol（標準DM EM培地の濃度）から10 mmol（生体内のECMの濃度）に増加すると、 35 S（硫酸塩）の取り込み量は半分に増加します。0.5 mmol未満のカルシウム濃度では成熟ウシ軟骨細胞によるコラーゲン産生が促進されましたが、1～2 mmol（標準DM EM培地の濃度に相当）の濃度ではコラーゲン合成が大幅に減少しました。高カルシウムレベル（2～10 mmol）では、生合成が中程度に増加することが観察されました。さまざまな陽イオンが軟骨細胞とECMタンパク質の接着に関与しています。例えば、マグネシウムイオンとマンガンイオンはフィブロネクチンとII型コラーゲンへの接着を促進しますが、カルシウムイオンは軟骨細胞とタンパク質の接着には関与しません。したがって、記載した研究の結果は、標準培地で培養された軟骨細胞の生合成機能に対する、培地のカリウム、ナトリウム、カルシウムの細胞外イオンおよび浸透圧の変化の影響を示しています。
機械的ストレスによる軟骨細胞代謝への影響
関節の固定は可逆的な軟骨萎縮を引き起こし、これはECMの正常な代謝プロセスに機械的刺激が必要であることを示しています。ほとんどの場合、使用される細胞培養モデルは常圧下で存在します。M. Wrightら（1996）は、機械的環境が軟骨細胞の代謝に影響を与え、細胞応答は圧縮荷重の強度と頻度に依存することを示しました。in vitroでの無傷の関節軟骨の組織片への荷重実験では、静的荷重下ではタンパク質とプロテオグリカンの合成が減少するのに対し、動的荷重はこれらのプロセスを刺激することが示されました。軟骨に対する機械的荷重の影響の正確なメカニズムは複雑であり、おそらく細胞の変形、静水圧、浸透圧、電位、およびマトリックス分子の表面細胞受容体に関連しています。これらの各パラメータの影響を研究するには、1つのパラメータを独立して変化させることができるシステムを作成する必要があります。例えば、組織片培養は細胞変形の研究には適していませんが、軟骨細胞の代謝活動に対する圧力の一般的な影響を研究するには使用できます。軟骨の圧迫は細胞の変形を招き、静水圧勾配、電位、流体の流れ、そしてマトリックス中の水分含有量、電荷密度、浸透圧レベルなどの物理化学的パラメータの変化を伴います。細胞変形は、単離した軟骨細胞をアガロースゲルまたはコラーゲンゲルに浸漬することで研究できます。
軟骨細胞培養に対する機械的刺激の効果を研究するためのシステムがいくつか開発されている。一部の研究者は、圧力を気相を通して細胞培養に加えるシステムを使用している。例えば、JP Veldhuijzen ら (1979) は、大気圧より 13 kPa 高い圧力を低周波数 (0.3 Hz) で 15 分間かけた結果、cAMP とプロテオグリカンの合成が増加し、DNA 合成が減少するのを観察した。R. Smith ら (1996) は、初代培養したウシ軟骨細胞を 1 Hz の周波数で静水圧 (10 MPa) に 4 時間断続的にさらすと、アグリカンと II 型コラーゲンの合成が増加したが、一定圧力ではこれらのプロセスに影響がなかったことを示した。同様のシステムを使用して、Wright ら (1996) は、細胞培養に対する周期的な圧力が、軟骨細胞膜の過分極と Ca 2+依存性カリウムチャネルの活性化に関連することを報告した。このように、周期的圧力の影響は、軟骨細胞膜内の伸張活性化イオンチャネルを介して媒介されます。軟骨細胞の静水圧に対する応答は、細胞培養条件と負荷周波数に依存します。例えば、周期的静水圧（5 MPa）は、0.05、0.25、および0.5 Hzの周波数で軟骨細胞単層への硫酸塩の取り込みを減少させますが、0.5 Hzを超える周波数では軟骨組織片への硫酸塩の取り込みが増加します。
M. Bushmannら (1992) は、アガロースゲル中の軟骨細胞が、培養された健常臓器と同様に、静的および動的機械的負荷に応じて生合成を変化させることを報告した。著者らは、機械的負荷が軟骨細胞に高浸透圧刺激を与え、それに続いてpHが低下することを明らかにした。
機械的伸張の効果は、ゲルに浸した細胞培養で研究できます。伸張力は、コンピュータ制御の真空を使用して生成できます。システムが特定の真空度下にある場合、細胞培養の入ったペトリ皿の底が既知の量だけ伸び、変形は皿の底の端で最大になり、中央で最小になります。伸張はペトリ皿で培養された軟骨細胞にも伝達されます。この方法を使用して、K. Holm-vall ら (1995) は、コラーゲン (タイプ II) ゲルで培養された軟骨肉腫細胞で、α 2 -インテグリンの mRNA の発現が増加することを示しました。α 2 βインテグリンは、タイプ II コラーゲンに結合することができます。これはアクチン結合タンパク質と相互作用して ECM と細胞骨格を接続するため、機械受容体であると考えられています。
軟骨細胞の代謝に対するpHの影響
軟骨組織の細胞外マトリックス（ECM）間質液のpHは、他の組織よりも酸性度が高い。A. Maroudas (1980) は、関節軟骨マトリックスのpHを6.9と測定した。B. Diamant et al. (1966) は、病的条件下でのpHが5.5であることを明らかにした。軟骨細胞は低PO₂環境で生存することが知られており、これはこれらの細胞の代謝において解糖（全グルコース代謝の95%）が重要な役割を果たしていることを示している。解糖は大量の乳酸の生成を伴う。
解糖産物による環境の酸性化に加えて、マトリックス成分自体も非常に重要です。プロテオグリカン上の大量の固定負電荷は、細胞外イオン組成を変更します。つまり、高濃度の遊離カチオン（例：H +、Na +、K +）と低濃度のアニオン（例：O2、HCO3）が観察されます。さらに、機械的負荷の影響下では、ECMから水が排出され、固定負電荷の濃度が増加し、より多くのカチオンがマトリックスに引き込まれます。これは細胞外環境のpHの低下を伴い、細胞内pHに影響を与え、それによって軟骨細胞の代謝を変更します。R. WilkinとA. Hall（1995）は、単離されたウシ軟骨細胞によるマトリックスの生合成に対する細胞外および細胞内環境のpHの影響を研究しました。彼らは、pHの低下によるマトリックス合成の二重の変化を観察しました。 pHがわずかに低下すると（7.4
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培養培地の組成が軟骨細胞の代謝に及ぼす影響
軟骨細胞を培養するための培地は、実験条件に適合する必要があります。近年では、培養条件を最適化するために子牛血清が使用されています。しかし、血清を使用する場合は、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。
- 臓器培養における組織の周縁部からの細胞の外側への成長、
- 異なるシリーズの血清の組成のばらつき、
- 未知の成分が含まれていること、
- さまざまな生物学的因子が細胞の代謝活動に及ぼす影響を研究する際に、干渉やアーティファクトが発生するリスクが高まります。
後者の例として、ラットの軟骨細胞に対するEGFの効果に関する研究があります。EGFは3H-チミジンの取り込みを刺激し、培養液中のDNA含量を増加させました。この効果は血清中濃度が低い場合（1%未満）により顕著でしたが、高濃度（7.5%超）では効果が消失しました。
子牛血清を添加した DMEM では、合成および分解のレベルが in vivo 条件と比較して大幅に増加することがよく知られています。in vivo と in vitro の代謝の差は、滑液と細胞を培養する培地の差によるものと考えられます。Lee ら (1997) は、20% 子牛血清を添加した DMEM と大量の正常同種滑液を含む栄養培地を使用して、若いウシ軟骨細胞をアガロースで培養しました。培地中に滑液が存在すると、プロテオグリカンの量が増加し、滑液の総量の最大 80% に達しました。これらの結果は、培養された滑液が、高レベルのグリコサミノグリカン合成と低レベルの細胞分裂を伴い、in vivo と同様のレベルの代謝を誘導することを示しています。
G. Verbruggen ら (1995) は、血清を含まない DMEM 培地中のアガロースで培養したヒト軟骨細胞による35 S-arrpeKaHa の合成が、10% 子牛血清を添加した DMEM 培地で観察された合成レベルの 20～30% であったことを示した。著者らは、IGF-1、IGF-2、TGF-R、またはインスリンが血清を含まない培地でのアグリカン産生をどの程度回復させたかを測定した。著者らは、100 ng/ml のインスリン、IGF-1、または IGF-2 が、アグリカン合成を対照レベルの 39～53% に部分的に回復させたと結論付けた。列挙した因子の組み合わせによる相乗効果や蓄積は認められなかった。同時に、100 ng/ml のインスリン存在下で 10 ng/ml の TGF-R が、アグリカン合成を基準レベルの 90% 以上まで刺激した。最後に、ヒト血清トランスフェリンは、単独またはインスリンとの組み合わせで、アグリカン合成に影響を与えませんでした。子牛血清をウシ血清アルブミンに置き換えると、アグリカン凝集体の含有量が大幅に減少しました。インスリン、IGF、またはTGF-Rで培養培地を強化すると、細胞のアグリカン凝集体生成能力が部分的に回復しました。さらに、IGF-1とインスリンは細胞培養において恒常性を維持できます。10～20 ng/mlのIGF-1を添加した培地で40日間培養した後、プロテオグリカン合成は、20%の子牛血清を含む培地と比較して同等かそれ以上のレベルに維持されました。IGF-1を添加した培地では、0.1%アルブミン溶液を添加した培地よりも異化プロセスが遅く進行しましたが、20%血清を添加
D. Lee ら (1993) は、軟骨組織片培養、単層培養、アガロース懸濁液における培養培地組成 (DMEM、DMEM+20% 子牛血清、DMEM+20 ng/ml IGF-1) の DNA 合成への影響を比較しました。血清存在下でアガロースで培養した場合、著者らは軟骨細胞が大きなクラスターに集まる傾向を観察しました。血清なし、または IGF-1 ありで培養した細胞はアガロース中で丸い形を保ち、小さなグループに集まりましたが、大きな凝集体を形成しませんでした。単層では、血清含有培地の方が IGF-1 強化培地よりも DNA 合成が有意に高く、後者の DNA 合成は非強化培地よりも有意に高かったです。同時に、血清を豊富に含んだ培地でアガロース中の軟骨細胞懸濁液を培養すると、他の培地に比べて放射性ヌクレオチド3 H-チミジンの取り込みが増加しました。
ビタミンCは、コラーゲン原線維の安定したらせん構造の形成に関与する酵素の活性化に不可欠です。アスコルビン酸が欠乏している軟骨細胞は、水酸化が不十分な非らせんコラーゲン前駆体を合成し、分泌が遅くなります。アスコルビン酸（50μg/ml）を投与すると、II型およびIX型コラーゲンが水酸化され、正常な量の分泌が促されます。ビタミンCの添加はプロテオグリカンの合成レベルに影響を与えませんでした。したがって、コラーゲンの分泌はプロテオグリカンの分泌とは独立して制御されています。