変形性関節症の病因における酵素とサイトカインの役割

近年、変形性関節症における関節軟骨ECMの分解に関与するプロテアーゼの特定に、研究者の注目が集まっています。現代の概念によれば、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は変形性関節症の病因において重要な役割を果たしています。変形性関節症患者では、コラーゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナーゼという3種類のMMPの濃度上昇が認められます。コラーゲナーゼは天然コラーゲン、ストロメリシンはIV型コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニンの分解に関与し、ゼラチナーゼはゼラチン、IV型コラーゲン、Vh XI型コラーゲン、エラスチンの分解に関与します。さらに、MMPの特性を持ち、軟骨性プロテオグリカン凝集体のタンパク質分解に関与するアグリカナーゼという別の酵素の存在が推定されています。

人間の関節軟骨では3種類のコラーゲナーゼが同定されており、変形性関節症患者ではそのレベルが著しく上昇しています。コラーゲナーゼ-1（MMP-1）、コラーゲナーゼ-2（MMP-8）、コラーゲナーゼ-3（MMP-13）です。関節軟骨に3種類の異なるコラーゲナーゼが共存していることは、それぞれが特定の役割を果たしていることを示唆しています。実際、コラーゲナーゼ-1と-2は主に関節軟骨の表層および上部中間層に局在し、コラーゲナーゼ-3は下部中間層および深層に存在します。さらに、免疫組織化学研究の結果、変形性関節症が進行するにつれて、コラーゲナーゼ-3のレベルはプラトーに達し、さらには減少する一方で、コラーゲナーゼ-1のレベルは徐々に増加することが実証されました。変形性関節症において、コラーゲナーゼ-1は主に関節軟骨の炎症プロセスに関与し、コラーゲナーゼ-3は組織のリモデリングに関与しているという証拠があります。 OA 患者の軟骨に発現するコラーゲナーゼ 3 は、コラーゲナーゼ 1 よりも強力に II 型コラーゲンを分解します。

第2群のメタロプロテアーゼの代表例として、ストロメリシン-1（MMP-3）、ストロメリシン-2（MMP-10）、ストロメリシン-3（MMP-11）の3つがヒトストロメリシンにも同定されています。現在、変形性関節症の病態に関与しているのはストロメリシン-1のみであることが分かっています。ストロメリシン-2は変形性関節症患者の滑膜では検出されませんが、関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞には微量に存在します。ストロメリシン-3も、関節リウマチ患者の滑膜の線維芽細胞近傍、特に線維化領域に存在します。

人間の軟骨組織中のゼラチナーゼのグループでは、92 kD ゼラチナーゼ (ゼラチナーゼ B、または MMP-9) と 72 kD ゼラチナーゼ (ゼラチナーゼ A、または MMP-2) の 2 つだけが特定されています。変形性関節症の患者では、92 kD ゼラチナーゼのレベルが上昇していることが確認されています。

最近、細胞膜表面に局在する膜型MMP（MMP-MT）と呼ばれる別のMMPグループが同定されました。このグループには、MMP-MT1～MMP-MT-4の4つの酵素が含まれます。MMP-MTの発現はヒト関節軟骨で確認されています。MMP-MT-1はコラーゲナーゼ活性を有しますが、MMP-MT-1とMMP-MT-2はどちらもゼラチナーゼ72 kDaとコラーゲナーゼ3を活性化することができます。OAの病態におけるこのMMPグループの機能については、解明が必要です。

プロテアーゼは酵素原として分泌され、他のプロテアーゼまたは有機水銀化合物によって活性化されます。MMPの触媒活性は、酵素の活性領域における亜鉛の存在に依存します。

MMP の生物学的活性は、特定の TIMP によって制御されます。現在までに、ヒトの関節組織で発見された TIMP には TIMP-1 ～ TIMP-3 の 3 種類があります。4 つ目の種類の TIMP も特定されクローン化されていますが、ヒトの関節組織ではまだ検出されていません。これらの分子は MMP の活性部位に特異的に結合しますが、その一部は 72 kD プロゼラチナーゼ (TIMP-2、-3、-4) および 92 kD プロゼラチナーゼ (TIMP-1 および -3) の活性部位に結合できます。OA では、関節軟骨で MMP と TIMP のバランスが崩れ、その結果、組織内の活性 MMP レベルの上昇が一因となって、阻害因子が相対的に不足していることが示唆されています。TIMP-1 および -2 は関節軟骨に存在し、軟骨細胞によって合成されます。変形性関節症では、滑膜および滑液中にI型TIMPのみが検出されます。TIMP-3は細胞外マトリックス（ECM）にのみ存在します。TIMP-4は、そのアミノ酸配列の約50%をTIMP-2と、38%をTIMP-1と共有しています。他の標的細胞において、TIMP-4は細胞表面の72kDプロゼラチナーゼの活性化を調節する役割を担っており、細胞外マトリックス（ECM）リモデリングの組織特異的な調節因子として重要な役割を果たしていることが示唆されています。

MMPの生物学的活性を制御するもう一つのメカニズムは、生理学的活性化です。AP/プラスミンやカテプシンBといったセリンプロテアーゼファミリーおよびシステインプロテアーゼファミリーに属する酵素が、MMPの生理的活性化因子であると考えられています。変形性関節症患者の関節軟骨では、ウロキナーゼ（uAP）とプラスミンの濃度が上昇していることが報告されています。

関節組織には数種類のカテプシンが存在するが、軟骨中の MMP を活性化させる可能性が最も高いのはカテプシン B であると考えられている。ヒトの関節組織では、セリンおよびシステイン プロテアーゼの生理学的阻害剤が見つかっている。変形性関節症患者では、AP-1 阻害剤 (IAI-1) だけでなくシステイン プロテアーゼの活性も低下している。MMP/TIMP と同様に、変形性関節症患者の関節軟骨における MMP の活性上昇は、セリンおよびシステイン プロテアーゼとそれらの阻害剤間の不均衡によって説明できる。さらに、MMP は互いを活性化することができる。たとえば、ストロメリシン-1 は、コラーゲナーゼ-1、コラーゲナーゼ-3、92 kD ゼラチナーゼを活性化し、コラーゲナーゼ-3 は 92 kD ゼラチナーゼを活性化する。 MMP-MTはコラーゲナーゼ-3を活性化し、ゼラチナーゼ-72 kDaはこの活性化を増強します。また、MMP-MTはゼラチナーゼ-72 kDaも活性化します。サイトカインは、破壊性（炎症性）、制御性（抗炎症性を含む）、同化性（成長因子）の3つのグループに分けられます。

サイトカインの種類 (van den Berg WB らによる)

破壊的	インターロイキン-1 TNF-α 白血病阻害因子 インターロイキン-17
規制	インターロイキン-4 インターロイキン-10 インターロイキン-13 酵素阻害剤
アナボリック	インスリン様成長因子 TGF-β 骨形成タンパク質 軟骨由来の形態形成タンパク質

破壊性サイトカイン、特にIL-1は、プロテアーゼの放出を増加させ、軟骨細胞によるプロテオグリカンおよびコラーゲンの合成を阻害します。制御性サイトカイン、特にIL-4およびIL-10は、IL-1の産生を阻害し、IL-1受容体拮抗薬（IL-1RA）の産生を増加させ、軟骨細胞中のNO合成酵素のレベルを低下させます。このように、IL-4は3つの方向でIL-1に拮抗します。1) 産生を減少させ、その効果を阻害する、2) 主要な「スカベンジャー」であるIL-1RAの産生を増加させる、3) 主要な二次「メッセンジャー」であるNOの産生を減少させる。さらに、IL-4は組織の酵素分解を抑制します。生体内では、IL-4とIL-10の併用により最適な治療効果が得られます。 TGF-βやIGF-1などの同化因子は、実際にはIL-1の生成や作用を妨害するわけではありませんが、プロテオグリカンやコラーゲンの合成を刺激したり、プロテアーゼの活性を抑制したりするなど、反対の作用を示します。また、TGF-βは酵素の放出を阻害し、その阻害剤を刺激します。

炎症性サイトカインは、関節組織におけるMMPの合成と発現の増加に関与しています。MMPは滑膜で合成され、滑液を介して関節軟骨に拡散します。炎症性サイトカインは軟骨細胞を活性化し、軟骨細胞もまた炎症性サイトカインを産生する能力を有します。変形性関節症の関節では、炎症のエフェクターとしての役割は主に滑膜細胞が担っています。プロテアーゼや炎症性メディエーターを分泌するのは、マクロファージ型の滑膜細胞です。これらの因子の中でも、IL-f、TNF-a、IL-6、白血病阻害因子（LIF）、IL-17は、変形性関節症の病態形成に最も深く関与しています。

変形性関節症における関節軟骨の分解を促進する生理活性物質

• インターロイキン-1
• インターロイキン3
• インターロイキン-4
• TNF-α
• コロニー刺激因子：マクロファージ（単球）および顆粒球マクロファージ
• サブスタンスP
• PGE2
• プラスミノーゲン活性化因子（組織型およびウロキナーゼ型）およびプラスミン
• メタロプロテアーゼ（コラーゲナーゼ、エラスターゼ、ストロメリシン）
• カテプシンAとB
• トリルシン
• 細菌性リポ多糖類
• ホスホリパーゼAg

文献データによると、IL-1と、おそらくTNF-αが変形性関節症における関節組織破壊の主なメディエーターであることを示しています。しかし、それらが互いに独立して作用するのか、またはそれらの間に機能的な階層関係があるのかはまだわかっていません。変形性関節症の動物モデルでは、IL-1阻害は関節軟骨の破壊を効果的に防ぐのに対し、TNF-α阻害は関節組織の炎症の減少のみをもたらすことが示されています。患者の滑膜、滑液、および軟骨では、両方のサイトカインの濃度の上昇が見られました。軟骨細胞では、これらはプロテアーゼ（主にMMPとAP）だけでなく、I型やIII型などのマイナーコラーゲンの合成も増加させ、II型とIX型コラーゲンおよびプロテオグリカンの合成を減少させることができます。これらのサイトカインは、活性酸素種やPGE ₂などの炎症メディエーターも刺激します。変形性関節症における関節軟骨のこのような高分子変化の結果、修復プロセスが無効になり、軟骨のさらなる劣化につながります。

上記の炎症性サイトカインは、変形性関節症におけるMMPの抑制／活性化のプロセスを調節します。例えば、変形性関節症の軟骨におけるTIMP-1とMMPのレベルの不均衡は、IL-1によって媒介されている可能性があります。in vitro試験では、IL-1β濃度の上昇がTIMP-1濃度の低下と軟骨細胞によるMMP合成の増加につながることが実証されています。AP合成もまたIL-1βによって調節されます。in vitroにおいて、関節軟骨細胞をIL-1で刺激すると、用量依存的にAP合成が増加し、iAP-1合成が急激に減少します。IL-1がiAP-1合成を抑制し、AP合成を促進する能力は、プラスミン生成とMMP活性化の強力なメカニズムです。さらに、プラスミンは他の酵素を活性化する酵素であるだけでなく、直接的なタンパク質分解による軟骨分解のプロセスにも関与しています。

IL-ipは、質量31kDの不活性前駆体（pre-IL-ip）として合成され、シグナルペプチドの切断後、質量17.5kDの活性サイトカインに変換されます。滑膜、滑液、関節軟骨などの関節組織では、IL-ipは活性型で存在し、in vivo研究では、変形性関節症における滑膜がこのサイトカインを分泌する能力があることが実証されています。一部のセリンプロテアーゼは、pre-IL-ipを生理活性型に変換することができます。哺乳類では、このような特性を持つのは、システインアスパラギン酸特異的酵素ファミリーに属するIL-1β変換酵素（ICF、またはカスパーゼ-1）と呼ばれるプロテアーゼのみです。この酵素は、pre-IL-ipを質量17.5kDの生物学的に活性な「成熟」IL-ipへと特異的に変換することができます。 ICFは細胞膜に局在する45kDのプロ酵素（p45）です。p45プロ酵素がタンパク質分解によって切断されると、p10およびp20と呼ばれる2つのサブユニットが形成され、酵素活性を特徴とします。

TNF-αは、質量26kDaの膜結合型前駆体としても合成され、タンパク質分解によって17kDaの活性型可溶性タンパク質として細胞外に放出されます。タンパク質分解は、アダマリジンファミリーに属するTNF-α変換酵素（TNF-AC）によって行われます。AR Aminら（1997）は、変形性関節症患者の関節軟骨においてTNF-AC mRNAの発現が増加していることを発見しました。

IL-1およびTNF-αによる軟骨細胞および滑膜細胞の生物学的活性化は、細胞表面の特定の受容体（IL-RおよびTNF-R）への結合によって媒介されます。各サイトカインには、IL-IPタイプIおよびII、およびTNF-RタイプI（p55）およびII（p75）の2種類の受容体が同定されています。IL-1PIおよびp55は、関節組織細胞におけるシグナル伝達を担っています。IL-1RタイプIは、IL-1αよりもIL-1βに対してわずかに高い親和性を有します。一方、IL-1RタイプIIは、IL-ipよりもIL-1αに対して高い親和性を有します。 IL-IPタイプIIがIL-1シグナルを媒介するのか、それともIL-1とIL-1受容体タイプIの結合を競合的に阻害するだけなのかは依然として不明である。変形性関節症患者の軟骨炎細胞および滑膜線維芽細胞には、IL-1PIとp55が大量に含まれており、これがこれらの細胞が対応するサイトカインによる刺激に対して高い感受性を示す理由である。このプロセスは、タンパク質分解酵素の分泌増加と関節軟骨の破壊の両方につながる。

変形性関節症の病理過程におけるIL-6の関与は否定できない。この仮説は、以下の観察に基づいている。

• IL-6は滑膜の炎症細胞の数を増加させ、
• IL-6は軟骨細胞の増殖を刺激し、
• IL-6 は、MMP 合成を増加させ、プロテオグリカン合成を阻害する IL-1 の効果を高めます。

しかし、IL-6 は TIMP の産生を誘導することができますが、MMP の産生には影響を及ぼさないため、このサイトカインはフィードバック メカニズムによって実行される関節軟骨のタンパク質分解の阻害プロセスに関与していると考えられています。

IL-6ファミリーのもう一つのメンバーであるLIFは、炎症性サイトカインであるIL-1βおよびTNF-αの刺激を受けて、変形性関節症患者の軟骨細胞から産生されるサイトカインです。LIFは、軟骨プロテオグリカンの再吸収、MMPの合成、およびNO産生を促進します。このサイトカインの変形性関節症における役割は、未だ十分に解明されていません。

IL-17は20～30kDのホモ二量体で、IL-1と同様の作用を有するものの、その効果ははるかに弱い。IL-17は、ヒトマクロファージなどの標的細胞において、IL-1β、TNF-α、IL-6、MMPなど、多くの炎症性サイトカインの合成と放出を刺激する。さらに、IL-17は軟骨細胞によるNO産生を刺激する。LIFと同様に、OAの病態におけるIL-17の役割については十分に研究されていない。

無機フリーラジカルであるNOは、OAにおける関節軟骨の分解において重要な役割を果たしています。変形性関節症患者から単離された軟骨細胞は、正常細胞と比較して、自発的および炎症性サイトカイン刺激後のいずれにおいても、より多くのNOを産生します。変形性関節症患者の滑液および血清には高いNO含有量が認められていますが、これはNO産生を担う酵素である誘導性NO合成酵素（hNOC）の発現および合成の増加によるものです。最近、軟骨細胞特異的hNOCのDNAがクローニングされ、酵素のアミノ酸配列が決定されました。このアミノ酸配列は、内皮細胞および神経組織特異的hNOCと50%の同一性と70%の類似性を示しました。

NOは関節軟骨の細胞外マトリックス（ECM）の高分子合成を阻害し、MMPの合成を促進する。さらに、NO産生の増加は、軟骨細胞によるIL-IP拮抗薬（IL-1RA）の合成の減少を伴う。したがって、IL-1レベルの上昇とIL-1RAの減少は、軟骨細胞におけるNOの過剰刺激につながり、ひいては軟骨マトリックスの分解を促進する。選択的hNOC阻害剤が実験的変形性関節症の進行を抑制するという生体内研究での報告がある。

天然サイトカイン阻害剤は、サイトカインが細胞膜受容体に結合するのを直接阻害し、炎症誘発活性を低下させます。天然サイトカイン阻害剤は、その作用機序に基づいて3つのクラスに分けられます。

最初のクラスの阻害剤には、結合部位を巡って競合することにより、リガンドが受容体に結合するのを阻害する受容体拮抗薬が含まれます。現在までに、このような阻害剤はIL-1に対してのみ発見されており、これは前述のIL-1/ILIPシステムの競合阻害剤であるIL-1PAです。IL-1PAは、滑膜細胞によるプロスタグランジンの合成、軟骨細胞によるコラーゲナーゼの産生、関節軟骨の骨髄の分解など、変形性関節症の関節組織で観察される多くの作用を阻害します。

IL-1RAには、可溶性IL-1RA（rIL-1RA）と細胞間型IL-1RA（μIL-1PAIおよびμIL-1RAP）の2種類の形態があります。可溶性IL-1RAの親和性は、細胞間型の5倍です。しかし、精力的な科学的研究にもかかわらず、後者の機能は未だ解明されていません。in vitro実験では、IL-1βの活性阻害には通常の10～100倍のIL-1RA濃度が必要であるのに対し、in vivoでは1000倍のIL-1RA濃度が必要であることが示されています。この事実は、変形性関節症患者の滑膜におけるIL-1RAの相対的欠乏とIL-1の過剰を部分的に説明できる可能性があります。

天然サイトカイン阻害剤の2つ目のクラスは、可溶性サイトカイン受容体です。ヒトにおいて変形性関節症の病態に関連するこのような阻害剤の例としては、rIL-1Rとpp55が挙げられます。可溶性サイトカイン受容体は通常の受容体の短縮形であり、サイトカインに結合すると、競合的拮抗作用によって標的細胞の膜結合受容体へのサイトカインの結合を阻害します。

可溶性受容体の主な前駆体は膜結合型IL-1RPです。rIL-IPのIL-1およびIL-1RAに対する親和性は異なります。そのため、rIL-1RNはIL-1RAよりもIL-1βに対して高い親和性を示し、rIL-1PIはIL-ipよりもIL-1RAに対して高い親和性を示します。

TNFには、可溶性受容体pp55とpp75の2種類があり、可溶性IL-1受容体と同様に「脱落」によって形成されます。生体内では、どちらの受容体も罹患関節の組織に存在します。変形性関節症の病態における可溶性TNF受容体の役割については議論が続いています。低濃度ではTNFの三次元構造を安定化させ、生理活性サイトカインの半減期を延長させると考えられていますが、高濃度のpp55とpp75では、競合的拮抗作用によってTNFの活性を低下させる可能性があります。おそらく、pp75はTNFのキャリアとして作用し、膜結合受容体への結合を促進すると考えられます。

天然サイトカイン阻害剤の3番目のクラスは、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13を含む抗炎症サイトカイン群に代表されます。抗炎症サイトカインは、炎症誘発性プロテアーゼや一部のプロテアーゼの産生を抑制し、IL-1RAとTIMPの産生を刺激します。