変形性関節症の病態における結晶沈着の役割

塩基性リン酸カルシウム（BCP）結晶は、変形性関節症患者の30～60%の関節液中に見られます。A. Swan ら（1994）によると、カルシウム含有結晶は変形性関節症患者のはるかに多くの関節液中に見られますが、結晶が非常に小さいか数が少ないため、従来の技術では特定できません。関節液中の BCP 結晶の存在は、関節軟骨変性のレントゲン所見と相関しており、結晶のない膝関節の滲出液と比較して、より大量の滲出液を伴うことがあります。変形性膝関節症のレントゲン上の進行に影響を及ぼす因子に関する研究では、ピロリン酸カルシウム二水和物（CPPD）結晶の沈着が、不良な臨床的およびレントゲン学的転帰の予測因子であることが示されました。高齢患者を対象とした研究では、変形性関節症は特に膝の外側脛骨大腿骨部分と最初の3つの中手指節関節において、軟骨石灰化症と関連していることが明らかになりました。変形性関節症患者において、OFCとPFCの両方の結晶が見つかることは珍しくありません。

臨床的には、カルシウム結晶の沈着によって引き起こされる関節軟骨の変性は、一次性変形性関節症で見られるものとは異なります。結晶が軟骨変性の単なる随伴現象であるならば、一次性変形性関節症が最もよく発症する関節、すなわち膝、股関節、手の小関節に認められるはずです。一方、結晶沈着症は、肩、手首、肘など、一次性変形性関節症の典型ではない関節に最も多く発症します。関節液（滲出液）中の結晶の存在は、より重度の関節軟骨変性と関連しています。結晶沈着と軟骨変性のどちらが原因でどちらが結果であるかという問題は議論されています。中間的な立場をとるのは、軟骨代謝における一次的異常が軟骨変性を導き、二次的な結晶沈着が軟骨変性を促進するという仮説です（いわゆる増幅ループ理論）。

カルシウム結晶が関節軟骨を損傷する正確なメカニズムは不明ですが、以下にまとめます。理論的には、カルシウム結晶は直接軟骨細胞を損傷する可能性があります。しかし、組織学的検査で軟骨細胞の近くに結晶が見つかることは稀で、軟骨細胞に取り込まれることはさらに稀です。最も可能性の高いメカニズムは、滑膜ライニング細胞による結晶の貪食、それに続くタンパク質分解酵素の放出、または軟骨細胞の酵素放出を刺激するサイトカインの分泌です。この概念は、ピロリン酸関節症の急速進行性変形性関節症の発症における PFKD 誘発性滑膜炎の役割に関する研究によって裏付けられています。この研究では、部分的外側半月板切除術によって誘発された変形性関節症のウサギの右膝に、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶 (1 または 10 mg) を毎週注入しました。8 回の注入後、右膝関節は左と比較して有意に深刻な変化を示していることが判明しました。滑膜炎症の強度は、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶の関節内注入量およびその投与量と相関していた。本研究で使用したCPPD結晶の投与量は生体内投与量を超えているにもかかわらず、結果は、ピロリン酸関節症における変形性関節症の進行においてCPPD誘発性炎症が役割を果たしていることを示唆している。

カルシウム含有結晶による関節軟骨損傷の誘発の潜在的メカニズムは、その細胞分裂促進特性、MMP を誘発しプロスタグランジン合成を刺激する能力に関連しています。

カルシウム含有結晶の細胞分裂促進作用。結晶関連関節症では、滑膜ライニング細胞の増殖が頻繁に観察されますが、結晶自体はこの過程の一部にしか関与していません。滑膜細胞数の増加はサイトカイン分泌の増加を伴い、これが軟骨溶解を促進し、タンパク質分解酵素の分泌を誘導します。ヒトの関節病変に認められる濃度のOFC結晶は、用量依存的に、休止期皮膚線維芽細胞培養、ならびにイヌおよびマウス滑膜線維芽細胞の細胞分裂促進を刺激します。ピロリン酸カルシウム二水和物、尿酸塩、硫酸塩、炭酸塩、およびリン酸カルシウムの結晶は、細胞の成長を刺激します。これらの結晶によって誘発される( ^3H )-チミジン取り込みの開始およびピークは、血清による細胞刺激と比較して3時間ずれています。この時間は、結晶の貪食および溶解に必要であると考えられます。同じサイズの対照結晶（ダイヤモンドダストやラテックス粒子など）を添加しても、細胞分裂は促進されなかった。尿酸ナトリウム一水和物結晶は細胞分裂促進効果が弱く、尿酸カルシウムに比べて著しく劣っていたことから、結晶中のカルシウム含有量が細胞分裂促進において重要であることが示唆された。合成OFC結晶は、軟骨石灰化症患者から採取した結晶と同様の細胞分裂促進効果を示した。カルシウム含有結晶の細胞分裂促進効果は、in vitroにおける周囲の栄養培地中のカルシウム含有量の増加によるものではない。なぜなら、栄養培地中の塩基性リン酸カルシウム結晶の溶解は、線維芽細胞による( ^3H )-チミジンの取り込みを刺激しなかったからである。

OFC 誘導性有糸分裂誘発のメカニズムとして提案されているもののひとつに、異常な滑膜細胞の増殖は、少なくとも部分的には、結晶のエンドサイトーシスと細胞内溶解が原因であり、これにより細胞質 Ca ²⁺濃度が上昇し、カルシウム依存性経路が活性化されて有糸分裂誘発が起こるというものがあります。この概念は、細胞培養を結晶にさらすと細胞増殖が誘発されるのに対し、そのような接触のない細胞にさらしても細胞増殖は誘発されなかったことから、有糸分裂を刺激するには細胞と結晶の直接的な接触が必要であるという要件によって裏付けられています。細胞-結晶相互作用後の結晶貪食の必要性を調べるため、細胞を⁴⁵ Ca-OPC および ( ^{3 H)-チミジンと共に培養しました。45} Ca-OPC を含む細胞は、塩基性リン酸カルシウム標識のない細胞よりも有意に多くの ( ³ H)-チミジンを取り込むことがわかりました。マクロファージ培養では、サイトカラシンによる結晶エンドサイトーシスの阻害が結晶溶解の阻害をもたらし、貪食の必要性がさらに強調されました。

カルシウム含有結晶は酸に可溶性である。貪食後、結晶はマクロファージのファゴリソソーム内の酸性環境下で溶解する。クロロキン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンA1、およびリソソームpHを上昇させる全てのリソソーム栄養剤は、塩基性リン酸カルシウム結晶と共に培養された線維芽細胞^において、用量依存的に細胞内結晶の溶解および(3H)-チミジンの取り込みを阻害する。

OFC結晶を単層線維芽細胞培養に添加すると、細胞内カルシウム濃度が即座に10倍に増加し、8分後にはベースライン値に戻った。塩基性リン酸カルシウム結晶はカルシウムを含まない培養液に添加されたため、カルシウムの供給源は主に細胞外イオンであった。細胞内カルシウム濃度の次の上昇は60分後に観察され、少なくとも3時間持続した。この場合、カルシウムの供給源はファゴリソソームに溶解した貪食された結晶であった。

OFC結晶の有糸分裂促進効果は、成長因子としてのPDGFの有糸分裂促進効果と類似していることがわかっており、後者と同様に、OFC結晶はIGF-1および血漿と相乗効果を示します。IGF-1の阻害は、OFCに反応する細胞の有糸分裂を減少させます。PG Mitchellら (1989) は、Balb/c- ₃ T3線維芽細胞におけるOFC結晶_による有糸分裂促進の誘導には、ホルモン、神経伝達物質、成長因子による細胞の外部刺激中に生成されるシグナルの主要なメディエーターの1つであるセリン/スレオニンプロテインキナーゼC (PKC) の存在が必要であることを示しました。Balb/c-3 T3細胞におけるPKC活性の低下は、 _{OFCを介したプロトオンコゲンc-fosおよびc-mycの誘導を阻害します}が、PDGFを介したこれらのオンコゲンの刺激には影響しません。

貪食された結晶の溶解に伴う細胞内カルシウム濃度の増加は、有糸分裂誘発の唯一のシグナル伝達経路ではありません。PDGFなどの成長因子が膜受容体に結合すると、ホスホリパーゼC（ホスホジエステラーゼ）が刺激され、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸を加水分解して細胞内メッセンジャーであるイノシトール3-リン酸とジアシルグリセロールを生成します。ホスホリパーゼCは、タンパク質キナーゼやプロテアーゼなどのカルシウム依存性およびカルシウム/カルモジュリン依存性酵素の活性を調節することにより、小胞体からカルシウムを放出します。

R. RothenbergとH. Cheung (1988)は、ウサギ滑膜細胞において、OFC結晶刺激に対するホスホリパーゼCによるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の分解が促進されることを報告した。後者は、( ^3H )-イノシトールで標識された細胞中のイノシトール-1-リン酸含量を有意に増加させ、そのピークは1分以内に到達し、約1時間持続した。

ジアシルグリセロールは、ピロリン酸カルシウム二水和物の潜在的活性化剤です。OFC結晶はホスホリパーゼCの活性を高め、それがジアシルグリセロールの蓄積につながるため、結果としてPKC活性化の増加が期待できます。PG Mitchellら (1989) は、Balb/c- _{3T3線維芽細胞}によるDNA合成に対するOFC結晶とPDGFの効果を比較しました。細胞培養では、ジアシルグリセロール類似体の腫瘍支持ホルボールジエステル (TPD) と共に細胞をインキュベートすることにより、PKCは不活性化されました。低用量のTPDで長期刺激するとPKC活性が低下しましたが、高用量のTPDで1回刺激するとPKCが活性化しました。OFC結晶によるDNA合成の刺激はPKC不活性化後に抑制され、OFC誘導性有糸分裂誘発におけるこの酵素の重要性を示しました。 （1987）は、ヒト線維芽細胞のOFC結晶に対する細胞分裂促進反応とPKC活性化との間に関連があることを実証した。しかし、OFC結晶はホスファチジルイノシトール3キナーゼやチロシンキナーゼを活性化しないことから、OFC結晶による細胞活性化のメカニズムは選択的であることが確認された。

細胞増殖は、プロトオンコゲンと呼ばれる一群の遺伝子によって制御されています。プロトオンコゲン c-fos と c-myc の産物であるタンパク質 foe と mye は細胞核に局在し、特定の DNA 配列に結合しています。3T3 線維芽細胞を OFC 結晶で刺激すると、数分以内に c-fos が発現し、刺激後 30 分で最大に達します。OFC 結晶または PDGF による c-myc 転写の誘導は 1 時間以内に起こり、刺激後 3 時間で最大に達します。細胞は少なくとも 5 時間、c-fos と c-myc の転写レベルを高めたままにします。PCD が不活性化された細胞では、OFC または TFD 結晶による c-fos と c-myc の刺激は大幅に抑制されますが、PDGF によるこれらの遺伝子の誘導は変化しません。

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAP K）ファミリーのメンバーは、様々な細胞内シグナル伝達カスケードの重要な調節因子です。このファミリーのサブクラスの一つであるp42/p44は、プロトオンコジーンであるc-fosとc-junの活性化を伴うメカニズムを介して細胞増殖を制御します。OFCおよびPFKD結晶は、p42とp44の両方が関与するプロテインキナーゼシグナル伝達経路を活性化することから、カルシウム含有結晶誘導性のマイトジェン形成においてこの経路が役割を果たしていることが示唆されます。

最後に、OFC誘導性の有糸分裂促進には、転写因子核因子κB（NF-κB）が関与しています。NF-κBは、免疫グロブリンκ軽鎖（IgK）遺伝子として初めて記述されました。NF-κBは誘導性転写因子であり、様々な遺伝子の発現を制御するため、多くのシグナル伝達経路において重要な役割を担っています。NF-κB誘導は通常、細胞質からIκBと呼ばれる阻害タンパク質の放出と連動しています。NF-κB誘導に続いて、活性転写因子が核へと移行します。OFC結晶は、Balb/c- _3T3線維芽細胞およびヒト皮膚線維芽細胞においてNF-κBを誘導します。

NF-κB活性化後のシグナル伝達には複数の経路が関与していると考えられますが、いずれもIκBをリン酸化（ひいては分解）するタンパク質キナーゼが関与しています。in vitro研究に基づき、IκBはこれまでキナーゼ（PKCやタンパク質キナーゼAなど）の基質として機能すると考えられていました。しかし、最近、高分子量のIκBキナーゼ複合体が同定されました。これらのキナーゼは、IκBのセリン残基を特異的にリン酸化します。TNF-αおよびIL-1によるNF-κB活性化には、NF-κB誘導キナーゼ（NIK）およびIκBキナーゼの効率的な作用が必要です。NIK活性化の分子メカニズムは現在不明です。OFC結晶はPKCとNF-κBの両方を活性化しますが、これら2つのプロセスがどの程度関連しているかは不明です。 GκBキナーゼの修飾はリン酸化を介して起こるため、OFC結晶によるNF-κB誘導において、PKCがリン酸化とGκBキナーゼの活性化を介して関与している可能性も否定できない。この概念は、PKC阻害剤スタウロスポリンがOFC結晶誘導性の有糸分裂誘発およびNF-κB発現を阻害するという事実によって裏付けられる。同様に、スタウロスポリンはGκBキナーゼを阻害することができ、ひいてはプロテインキナーゼAやその他のプロテインキナーゼも阻害する。

したがって、線維芽細胞における OFC 結晶誘導性有糸分裂のメカニズムには、少なくとも 2 つの異なるプロセスが含まれます。

• PKCとMAP Kの活性化、NF-κBとプロトオンコゲンの誘導をもたらす急速な膜結合イベント。
• ^{細胞内の結晶の溶解が遅くなり、細胞内のCa 2+}含有量が増加し、次に有糸分裂を刺激するいくつかのカルシウム依存性プロセスが活性化されます。

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

MMPカルシウム含有結晶による誘導

カルシウム含有結晶による組織損傷のメディエーターは、MMP（コラーゲナーゼ-1、ストロメリシン、92 kD ゼラチナーゼ、コラーゲナーゼ-3）です。

OFC結晶含有量と関節組織破壊の関係性から、OFC結晶、そしておそらく一部のコラーゲンが滑膜細胞によって貪食されるという仮説が提唱されました。刺激を受けた滑膜細胞は増殖し、プロテアーゼを分泌します。この仮説は、培養されたヒトまたはイヌの滑膜細胞に天然または合成OFC、PFCD、その他の結晶を添加することにより、in vitroで検証されました。中性プロテアーゼおよびコラーゲナーゼの活性は用量依存的に増加し、結晶を添加しない対照細胞培養と比較して約5～8倍に上昇しました。

結晶を含む培地で培養された細胞では、コラーゲナーゼ-1、ストロメリシン、ゼラチナーゼ-92 kDa mRNAの共誘導が検出され、続いて培地中に酵素が分泌されました。

OFC 結晶はまた、成熟した豚軟骨細胞におけるコラーゲナーゼ 1 およびコラーゲナーゼ 2 mRNA の蓄積を誘発し、続いて培地への酵素の分泌を引き起こしました。

GM McCartyら（1998）は、結晶誘導性MMP産生における細胞内結晶溶解の役割を研究した。バフィロマイシンAによるリソソームpHの上昇は細胞内結晶溶解を阻害し、ヒト線維芽細胞のOFC結晶に対する増殖反応を減弱させたが、MMPの合成および分泌は阻害しなかった。

塩基性リン酸カルシウム結晶も PFCD 結晶も in vitro では IL-1 産生を誘発しませんでしたが、尿酸ナトリウム結晶は誘発しました。

現在のデータは、カルシウム含有結晶との接触により線維芽細胞および軟骨細胞による MMP 生成が直接刺激されることを明確に示しています。

変形性関節症の症状は、MMPが病気の進行に重要な役割を果たしていることを示しています。カルシウム含有結晶の存在は、罹患関節の組織の変性を促進します。

プロスタグランジン合成の刺激

カルシウム含有結晶は、細胞の成長と酵素の分泌を促進するとともに、哺乳類細胞培養物からプロスタグランジン、特にPGE2の放出を引き起こします_。PGE2の放出は、いずれ_の場合も、細胞が結晶に曝露されてから1時間以内に起こります。R. Rothenberg (1987) は、PGE2の合成に必要なアラキドン酸の主な供給源はホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミン_であると結論付け、また、ホスホリパーゼA2_{とNOXがPGE2産生}の主要経路であることも確認しました。

PGE1もOFA結晶に反応して放出される。GM McCartyら（1993, 1994）は、PGE2 _、 PGE、およびその類似体であるミソプロストールがヒト線維芽細胞のOFA結晶に対する細胞分裂促進反応に及ぼす影響を研究した。3つの薬剤はすべて用量依存的に細胞分裂促進反応を阻害し、PGEとミソプロストールはより顕著な阻害活性を示した。PGE2とミソプロストールはOFA結晶に対するコラーゲナーゼmRNAの蓄積を阻害したが、PGE2_{は阻害しなかった。}

MG McCartyとH. Cheung (1994)は、PGEによるOFCを介した細胞活性化のメカニズムを解析した。著者らは、PGE2やPGEよりも強力な細胞内cAMP誘導剤であるPGEが、cAMP依存性シグナル伝達経路を介してOFC誘導性の有糸分裂誘発およびMMP産生を阻害することを示し_た。OFC結晶によって誘発されるPGE産生の増加は、フィードバック機構を介して他の生物学的効果（有糸分裂誘発およびMMP産生）を弱める可能性がある。

結晶誘発性炎症

カルシウム含有結晶は、変形性関節症患者の関節液中によく見られますが、白血球増多を伴う急性炎症のエピソードは、変形性関節症でも結晶関連関節症 (ミルウォーキー肩症候群など) でもまれです。結晶の炎症性ポテンシャルは、いくつかの阻害因子によって変更できます。R. Terkeltaub ら (1988) は、血清と血漿が、塩基性リン酸カルシウム結晶に対する好中球の反応を著しく阻害する能力があることを実証しました。このような阻害を引き起こす因子は、結晶結合タンパク質です。これらのタンパク質の 1 つである₂ -HS 糖タンパク質 (AHSr) の研究により、AHSР が、OFC 結晶に対する好中球の反応に対する最も強力で特異的な阻害剤であることが示されました。AHSr は肝臓起源の血清タンパク質です。他の血清タンパク質と比較して、骨および石灰化組織に比較的高濃度で存在することが知られています。さらに、AHSrは「非炎症性」滑液中に存在し、また、天然滑液中の塩基性リン酸カルシウム結晶にも検出されています。したがって、AHSrが生体内において塩基性リン酸カルシウム結晶の炎症性活性を調節する可能性は否定できません。

上記すべてを要約するために、WB van den Berg らによって提案された変形性関節症の病因に関する 2 つのスキームを紹介します。 (1999) および M. Carrabba et al. (1996)、機械的、遺伝的、生化学的要因を組み合わせたものです。