非ウイルス遺伝子治療により慢性腰痛に希望が生まれる

最近の研究が ジャーナル Biomaterials に掲載され、研究者らは、人工細胞外小胞 (eEV) を使用して転写因子 Forkhead Box F1 ( FOXF1 ) を変性椎間板 (IVD) に体内で送達することで、椎間板性腰痛 (DBP) を治療する新しい非ウイルス性遺伝子療法を開発しました。

慢性 腰痛 (LBP) は、人口の高齢化とオピオイド問題の悪化により、世界的に拡大している問題です。現在の治療法には、短期的な痛みの緩和や高額な手術が含まれており、非依存性で侵襲性の低い治療法の必要性が浮き彫りになっています。

成長因子投与、細胞療法、ウイルス遺伝子療法などの現在の生物学的療法は、動物モデルとヒトモデルの変性を軽減できます。しかし、短期的な影響、長期的な有効性の低さ、不必要な免疫原性や腫瘍形成性などの懸念から、これらの方法を直接適用することはできないかもしれません。

この研究では、研究者らは、FOXF1-eEV を使用して椎間板変性 (IVD) に対する非ウイルス性遺伝子治療を確立しました。

研究者らは、FOXF1 または対照として pCMV6 を含むプラスミドを初代マウス胎児線維芽細胞 (PMEF) にトランスフェクトし、ナノ粒子追跡アッセイ (NTA) を使用して eEV サンプルを特徴付けました。

研究者らは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) と従来の PCR を使用して、eEV への分子貨物の効率的な積載を評価しました。ウエスタンブロット分析により、eEV 形成における FOXF1 と特定の EV タンパク質が特定されました。研究チームは、上流および下流のポリリンカー領域を強化するプラスミドを使用して、ドナー細胞内の FOXF1 プラスミド DNA の存在を判定し、eEV を生成しました。

彼らは、eEV とドナー細胞内のプラスミド DNA から生成された全長 mRNA を調べました。

研究者は、DBP の動物モデルで組織機能を回復し、痛みの反応を修正するために、転写因子を含む細胞外小胞を作成しました。

彼らは、椎間板性腰痛のマウス モデルで損傷した椎間板に FOXF1 を輸送および分配する EV を特定し、椎間板変性に対する FOXF1 eEV の阻害を判定しました。

研究チームは、マウス椎間板の生体力学的テストと、画像、細胞外マトリックス (ECM) の変化、および 12 週間後に評価した痛みの反応を組み合わせ、構造と機能の変化、および治療介入によって誘発された痛みを確認しました。

術前および治療後の疼痛評価には、マイクロコンピューターによる評価が含まれていました。

この研究では、術後の痛みを抑えるためにマウスにブプレノルフィン ER を皮下注射するという外科的手法が用いられました。

研究チームは、オープン フィールド テスト、コールド プレート、尾懸垂、ワイヤー懸垂などのさまざまな手法を使用して、手術前と手術後 4 週間から 12 週間まで 2 週間ごとに行動評価を実施しました。

オープン フィールド テストではマウスの自発的な活動を評価し、コールド プレート テストでは温熱性痛覚過敏を測定し、尾懸垂テストでは軸痛を測定しました。ワイヤーサスペンションテストで強度を測定しました。

手術から12週間後、研究チームは動物の腰椎を解剖し、大腿神経と動脈のトレースを使用して、L4とL5、L5とL6、L6とS1 IVDの間の椎間板を特定しました。彼らはL5/L6 IVDを使用して組織学を評価し、グリコサミノグリカン（GAG）含有量を決定しました。

FOXF1 eEVは、椎間板の高さ、組織の水分補給、プロテオグリカン含有量、および機械的特性の改善など、IVDの構造と機能を回復しながら、痛みの反応を大幅に軽減しました。

この研究は、FOXF1転写因子を導入した一次線維芽細胞からのFOXF1搭載eEVの放出に焦点を当てました。定量的 RT PCR では、pCMV6 を導入した細胞と比較して、FOXF1 mRNA 転写レベルと完全長転写 FOXF1 mRNA レベルが大幅に増加していることが示されました。

FOXF1 eEV 療法は、腰椎椎間板穿刺マウス モデルで最大 12 週間、疼痛反応を軽減できます。メスのマウスでは、FOXF1 治療群の方が損傷群よりも長い取得時間を示し、治療後少なくとも 12 週間持続しました。

FOXF1 eEV 療法は、生体内で負傷動物および変性動物の水分補給と IVD 組織の高さを改善し、水分補給レベルと T2 強調 IVD 画像強度を維持しました。

ただし、チームは負傷動物および pCMV6 eEV で治療した動物で椎間板の高さの減少を観察しました。FOXF1 eEV で治療したマウスでは、治療後 12 週間で椎間板の高さが減少しませんでした。性別は機能結果に影響しませんでした。

FOXF1 eEV は、生体内で損傷および変性した IVD の機械的機能を回復しました。軸方向応力下では、FOXF1 eEV 処理された IVD は、損傷した IVD と比較して、より高い正規化 NZ 剛性を示しました。

クリープ条件下では、損傷した IVD は正規化クリープ変位の増加を示し、正規化クリープ弾性剛性の低下を示しました。

結果は、損傷した IVD の GAG 含有量を減らすと機械的柔軟性が増加するが、eEV 療法はグリコサミノグリカンの損失とそれに続く機械的機能の変化を防ぐことを示しています。

FOXF1 eEV は、プロテオグリカンと GAG のレベルを増加させることで、IVD の構造的および機能的変化を引き起こしました。

研究結果では、発達性転写因子を搭載した eEV は、これらの転写因子を変性および痛みを伴う IVD 関節に送達することで、DBP などの痛みを伴う関節疾患を治療できることが示されました。

この戦略は、疾患によって引き起こされる構造的および機能的異常を軽減し、性別特有の痛みを調節するのに役立つ可能性があります。

研究者らは、FOXF1 などの発達転写因子を使用して、変性 NP 細胞を生体内で同化促進状態に変換することも推奨しています。その治療効果を判断するには、さらなる研究が必要です。