非ウイルス性遺伝子治療が慢性腰痛に希望をもたらす

ジャーナル「Biomaterials」に掲載された最近の研究で、研究者らは、遺伝子操作された細胞外小胞（eEV）を使用して転写因子Forkhead Box F1（FOXF1）を体内の変性椎間板（IVD）に送達することで、椎間板性腰痛（DBP）を治療するための新しい非ウイルス性遺伝子治療法を開発した。

慢性的な腰痛（LBP）は、高齢化とオピオイド問題の悪化により、世界的に深刻な問題となっています。現在の治療法は短期的な痛みの緩和や高額な手術などであり、依存性がなく、より侵襲性の低い治療法の必要性が高まっています。

成長因子投与、細胞療法、ウイルス遺伝子療法といった現在の生物学的アプローチは、動物モデルおよびヒトモデルにおいて変性を軽減することができます。しかしながら、短期的な効果、長期的な有効性の低さ、不必要な免疫原性および発癌性といった問題が、これらのアプローチの直接的な応用を阻む可能性があります。

この研究では、研究者らはFOXF1-eEVを用いて椎間板変性（IVD）に対する非ウイルス性遺伝子治療法を確立した。

研究者らは、FOXF1 またはコントロールとして pCMV6 を含むプラスミドを初代マウス胎児線維芽細胞 (PMEF) に導入し、ナノ粒子追跡アッセイ (NTA) を使用して eEV サンプルを特徴付けました。

研究チームは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）と従来のPCRを用いて、eEVへの分子貨物の効率的な積載を評価した。ウェスタンブロット解析により、eEV形成中にFOXF1とEV特異的タンパク質が同定された。研究チームは、ドナー細胞および作製したeEVにおけるFOXF1プラスミドDNAの存在を確認するため、ポリリンカー領域の上部と下部を強化するプラスミドを用いた。

彼らは、eEV とドナー細胞内のプラスミド DNA から生成された完全長 mRNA を調べた。

研究者らは、DBP の動物モデルにおける組織機能を回復し、痛みの反応を変えるために、転写因子を含む細胞外小胞を作成しました。

研究者らは、椎間板性腰痛のマウスモデルにおいて、損傷した椎間板への FOXF1 の輸送と分布に関わる EV を特定し、椎間板変性に対する FOXF1 eEV の阻害を判定しました。

研究チームは、マウスの椎間板の生体力学的試験と画像診断、細胞外マトリックス（ECM）の変化、および12週間後に評価した痛みの反応を組み合わせ、治療介入によって引き起こされた構造と機能の変化、および痛みを確認した。

術前および術後の疼痛評価には、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）、磁気共鳴画像（MRI）、機械的試験、アルシアンブルー（AB）およびピクロシリウスレッド（PSR）染色、ジメチルメチレンブルー試験、および免疫組織化学（IHC）が含まれました。

この研究では、術後の痛みを抑えるために研究者らがマウスにブプレノルフィンERを皮下投与する手術手法が用いられた。

研究チームは、オープンフィールドテスト、コールドプレート、尾吊り、ワイヤー吊りなどさまざまな方法を用いて、手術前と手術後4～12週間まで2週間ごとに行動評価を実施した。

オープンフィールドテストではマウスの自発的な活動を評価し、コールドプレートテストでは温熱性痛覚過敏を測定し、尾懸垂テストでは軸方向の痛みを測定し、ワイヤー懸垂テストでは筋力を測定した。

手術から12週間後、研究チームは大腿神経と動脈のトレースを用いて動物の腰椎を解剖し、L4とL5、L5とL6、そしてL6とS1のIVD間の椎間板を特定しました。L5/L6のIVDを用いて組織学的評価を行い、グリコサミノグリカン（GAG）含有量を測定した。

FOXF1 eEV は、椎間板の高さ、組織の水分補給、プロテオグリカン含有量、機械的特性の改善など、IVD の構造と機能を回復しながら、疼痛反応を大幅に軽減しました。

本研究は、転写因子FOXF1を導入した初代線維芽細胞からFOXF1を担持したeEVの放出に焦点を当てた。定量的RT-PCRでは、pCMV6を導入した細胞と比較して、FOXF1 mRNA転写産物レベルおよび完全長転写されたFOXF1 mRNAレベルが有意に上昇していることが示された。

FOXF1 eEV療法は、マウスの腰椎椎間板穿刺モデルにおいて、最大12週間にわたり疼痛反応を軽減することができました。雌マウスでは、FOXF1投与群の発作時間は損傷群よりも長く、治療後少なくとも12週間持続しました。

FOXF1 eEV 療法により、生体内での損傷および変性動物の IVD 組織の水分補給と高さが改善され、水分補給レベルと IVD ディスクの T2 強調画像強度が維持されました。

しかし、研究チームは、損傷を受けた動物とpCMV6 eEVを投与された動物において椎間板高の減少を観察した。FOXF1 eEVを投与されたマウスでは、投与12週後も椎間板高の減少は認められなかった。性別は機能的転帰に影響を与えなかった。

FOXF1 eEVは、生体内で損傷および変性した体外受精（IVD）の機械的機能を回復させた。軸方向応力下では、FOXF1 eEV処理したIVDは、損傷したIVDと比較して、より高い正常化NZ剛性を示した。

クリープ条件下では、損傷した IVD は正規化クリープ変位の増加を示し、正規化クリープ弾性剛性の減少を示しました。

結果は、損傷したIVDのGAG含有量を減らすと機械的柔軟性が増すが、eEV療法はグリコサミノグリカンの損失とそれに伴う機械的機能の変化を防ぐことを示しています。

FOXF1 eEV はプロテオグリカンと GAG のレベルを上昇させることにより IVD の構造的および機能的変化を引き起こしました。

研究の結果、発達性転写因子を搭載したeEVは、IVDによってこれらの転写因子を変性関節や痛みを伴う関節に送達することで、DBPなどの痛みを伴う関節疾患を治療できることが示されました。

この戦略は、病気によって引き起こされる構造的および機能的異常を軽減し、性別に応じた方法で痛みの反応を調節するのに役立つ可能性があります。

研究者らはまた、FOXF1などの発達転写因子を用いて、変性NP細胞を生体内で同化促進状態へと移行させることを推奨した。その治療効果を明らかにするには、さらなる研究が必要である。