白色ラットの人工瘢痕への同種ケラチノサイト移植に関する実験的研究

細胞の潜在能力を利用したいという願望と、傷跡の美観を改善するための新しい効果的な方法を見つける必要性から、ケラチノサイトを傷跡の表面に移植する可能性を研究しようというアイデアが生まれました。

ケラチノサイト培養による瘢痕の外観改善の可能性を証明するため、白色実験用ラットを用いて瘢痕表面を作製した実験研究が行われた。ラットの瘢痕モデルは、背骨に沿って人為的に負わせた創傷を治癒させた結果得られた。ラットから2×3cmの大きさの同一サイズの皮膚片を切り出した。「瘢痕モデリング」手術から2.5ヶ月後、ラットは皮膚剥離術（熱腐食法を用いて瘢痕の上層を除去する手術）を受け、生後2～4日の仔ラットの皮膚から分離した同種ケラチノサイトを移植した。

ラット表皮細胞の分離と培養は、ロシア科学アカデミー細胞学研究所の細胞技術研究室で以下の技術を使用して実施されました。

皮膚は200 U/mlのゲンタマイシンを含むハンクス生理食塩水で洗浄し、面積0.2～0.5 cm²の小片に切断した^。皮膚片は、平衡塩リン酸緩衝液中の0.5%ディスパーゼ溶液中で37℃で1時間インキュベートした。その後、皮膚片をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に移し、表皮と真皮を分離した。表皮は0.125%トリプシン溶液中で10～15分間、50 rpmで撹拌しながらインキュベートし、その後、5%ウシ胎児血清を加えて酵素の作用を停止させた。得られた細胞懸濁液の3分の1は、瘢痕への移植方法の一つとして純粋な状態で使用し、残りの3分の1は生体適合性の家庭用フィルムコーティング「Polypor」上で培養し、残りの3分の1は基質を含まないペトリ皿上で培養した。ラットに生じた傷跡を削り取り、その後ラットの表皮細胞をその傷跡に移植する手術を、熱焼灼器を使用したエーテル麻酔下で実施した。

最初のグループのラットでは、皮膚剥離術後、生理食塩水で洗浄し乾燥させた傷跡の表面に滅菌カンブリック片を置き、その上にラット同種表皮細胞の振盪懸濁液を1mlあたり150万個（細胞学研究所による）の濃度で塗布した。カンブリック片は、細胞が傷跡の表面に重なるように研磨された傷跡に置いた。その上にガーゼを数枚重ねた包帯を置き、傷跡の縁に縫い付けた。

得られた細胞懸濁液の一部を、ペトリ皿の形状に切った滅菌ポリポアフィルム上のペトリ皿に播種し、他の部分はフィルムのないペトリ皿に播種した。培養は、DMEMとF12培地を3：1の比率で混合したFAD培地で行った。10％ウシ胎児血清、5μg / mlインスリン（シグマ）、0.5μg / mlヒドロコルチゾンヘミスクシネート（シグマ）、10μg / ml上皮成長因子EGF（ロシア科学アカデミー細胞学研究所、サンクトペテルブルク）を添加した。ラットの第2および第3グループ（それぞれ7匹）は、第1グループの6日後に手術を受けた。この時までに、ペトリ皿に播種したケラチノサイトの懸濁液から多層が形成され、ラットに移植された。第2グループにはフィルム上の表皮細胞が移植され、第3グループには基質のない多層が移植された。 7日後、「ポリポア」フィルム上に播種した同種異系ケラチノサイト（MPALK）の多層培養物を、創傷面に直接移植した。フィルムは剥がれないよう、多層ガーゼ包帯で固定し、ラットの皮膚に縫い付けた。

基質なしで培養した第3群のラットにケラチノサイトを移植する前に、真皮と表皮の結合を選択的に破壊する能力を持つディスパーゼで処理し、ペトリ皿の底からPACを分離しました。ディスパーゼは多層細胞層に作用すると、基底層細胞とペトリ皿の底との結合を破壊しますが、細胞間の結合にはほとんど影響を与えないため、層全体を「除去」することができます。ディスパーゼによる多層細胞層の剥離は、以下のように行いました。ペトリ皿から輸送培地を排出し、細胞層を抗生物質、特にゲンタマイシン（0.2 mg/ml）を含む栄養培地で3回洗浄しました。多層細胞層に0.125%ディスパーゼ溶液（「Sigma」）を充填し、恒温槽に入れ、37℃で20～30分間インキュベートしました。層の周囲に沿って白い縁が剥がれ始めると、ペトリ皿の縁と底から分離が始まります。分離開始から数分後、ディスパーゼ溶液を排出し、上皮層を培地で2～3回洗浄しました。カップのサイズに合わせて切った滅菌創傷被覆材「リタカラー」を表皮層の表面に貼り付け、ディスパーゼで分離した層をスパチュラでカップの底から剥がして貼り付けました。ピンセットを用いて、この層を「リタカラー」（ロシア製）のコーティングとともにペトリ皿の底から剥がし、準備しておいた傷跡の表面に慎重に移しました。ナプキン「リタカラー」にはゲンタマイシンとエキソリン（コラーゲン抽出物）が含まれており、成長培地の残りで湿らせ、その後生理食塩水で湿らせると膨張して現代の創傷被覆材となり、外部感染から適切に保護し、吸湿構造により治癒を早めます。

ポリポアフィルムとリタカラーナプキンの上に多層ガーゼ包帯を貼り、ラットの皮膚に縫い付けることで、より強固に固定しました。移植したケラチノサイトの維持と生着に最適な環境を整えるため、各ラットは別々のケージに入れました。ディスパーゼで除去した表皮細胞の懸濁液と多層を移植したラットの包帯は、細胞の生着に最も適した環境を整えるため、1日に数回滅菌生理食塩水で湿らせました。ポリポアフィルムは水を通さないため、第2群のラットの包帯は湿らせませんでした。これは、フィルムを使用しない移植に比べて優れた点の1つです。包帯は10日後に除去しました。細胞移植後の瘢痕の臨床像は、皮膚剥離によりピンク色になり、剥離が激しいことを除けば、移植なしの瘢痕とほとんど変わりませんでした。この事実は、 MPC とともに創傷被覆材が剥がれた直後には、傷跡に変化は見られなかった。

ラットから生検材料を採取する。

ラット同種角化細胞を白色ラットの研磨瘢痕に移植後1、2、5、9ヶ月経過した時点で、組織学的、細胞形態学的、電子顕微鏡的観察のために材料を採取した。対照として、正常ラット皮膚および細胞移植を行わない瘢痕のサンプルを採取した。ラットの麻酔はエーテル麻酔を用いて行った。

麻酔後、直径2mmの生検パンチを用いて、ケラチノサイト移植部位の瘢痕組織片を採取し、2.5%グルタルアルデヒド溶液に浸漬して電子顕微鏡観察用の試料とした。組織学的検査用に採取した組織片は、10%中性ホルマリン溶液に浸漬し、アルコール処理後、パラフィン包埋し、超薄切片を作製して光学顕微鏡で観察した。

コントロール I. 正常なラットの皮膚。

正常な瘢痕変化を起こしたラットの皮膚の顕微鏡写真と、MPC 移植後の特定の時期の瘢痕の違いを確認するために、本研究のすべての段階でそれらの写真と説明を示します。

正常な皮膚の表皮は7～9層の細胞から構成されています。角質層は中程度の厚さで、場所によっては6～8層の角質層から構成されています。基底層は、大きく軽い規則的な形の核と複数の核小体を持つ円筒状の細胞で構成されています。細胞間および基底膜とのデスモソーム結合が明確に表現されています。表皮下層に小さな突起を持つ明確な基底膜の下には、コラーゲンとエラスチンの繊細な繊維束が平行に存在し、その中には細長い線維芽細胞や小さな血管が含まれています。より深い層では、コラーゲンとエラスチンの繊維束がさまざまな方向に広がっています。その中には、同じ直径の薄い壁を持つ多数の血管、細胞要素（線維芽細胞、肥満細胞、白血球）があります。多数の毛包と脂腺があります。

コントロール 2。ネズミの傷跡、生後 2 か月。

臨床像。瘢痕は淡いピンク色で、剥離を伴い、一部に瘡蓋が残る。コラーゲン線維の収縮により瘢痕面積は縮小し、約3.0～3.5cmとなっている^。皮膚付属器は消失している。

顕微鏡写真。表皮は3～5層の細胞で構成され、丸い基底細胞、1列の有棘細胞、上層にケラトヒアリン粒子を含む1～2列の顆粒細胞で代表される折り畳まれた細胞で構成され、細胞内浮腫の領域があります。角質層は、非常に薄いものから厚くなったものまで不均一に変化しています。瘢痕組織の（収縮）による瘢痕の折り畳みが見られます。ひだは乳頭層まで浸透し、乳頭の印象を作り出します。表皮と真皮の境界は直線です。基底膜はどこにでも追跡できるわけではありません。表皮下層の下部とより深い層には、厚く緩んだ壁を持つ血管があり、その多くは空洞でうっ血しています。血管の周りには、マクロファージや線維芽細胞が蓄積しています。マクロファージは毛細血管から放出された赤血球を取り囲み、貪食します。より浅い層には小さな毛細血管があり、表皮の下にはコラーゲン繊維が緩く分布しています。瘢痕の深層には、コラーゲン繊維の粗い束があり、その中には多くの線維芽細胞が含まれています。

ラットのケラチノサイト移植後 1 か月のラットの瘢痕。

臨床像：瘢痕はピンク色で、面積、特に直径が縮小し、平均2.5～3cm²です^。毛と皮脂腺は消失しています。

フィルム上にMPaLKを移植したラットと、基質を用いずにMPaLKを移植したラットから得られた組織を顕微鏡で観察した結果は、実質的に同一でした。しかし、純粋に技術的な観点から言えば、基質を用いずにMPaLKを扱う作業は、基質を用いてMPaLKを培養する場合よりもはるかに複雑で骨の折れる作業です。そのため、瘢痕へのケラチノサイト移植に関する更なる研究においては、培養の基盤（「基質」）として多層カンブリックを使用しました。

顕微鏡写真。表皮は15～20層に肥厚しており、そのほぼ中央ではケラチノサイトが細長く垂直な形状をしており、コンパクトに配列しています。基底細胞は不均一な線状に並んでいます。核は軽く大きく、丸みを帯びており、1つまたは2つの核小体を有しています。これは、高い合成活性と増殖活性を示しています。表皮と真皮の境界は直線です。有棘層はよく発達しており、3～5層の丸い細胞で構成され、2つの核小体を持つ細胞があります。

基底膜直下には、コラーゲン繊維の細い束が密集しており、それらと平行に多数の無血管が存在します。深層ではコラーゲン繊維はより粗く、密集した束を形成しています。多数の大型線維芽細胞、肥満細胞（視野内に2～3個）、マクロファージ、白血球、そして壁が緩んだ無血管が見られ、その周囲にはコラーゲン繊維が緩く分布しています。一部の血管では、うっ血や形成された要素の漏出が見られます。血管の周囲には線維芽細胞とリンパ球が単独で存在します。皮膚付属器は存在しません。

研磨された傷跡にケラチノサイト懸濁液を移植すると、顕微鏡像は以前のものと異なります。ほとんどの動物では、表皮は薄く、5～6層の細胞で構成されています。下層は、不規則な多角形の細胞と、丸みを帯びた不規則な形状の核で構成されています。表皮下層の状態は、MPALK移植を受けていない動物群の状態と同様です。

この場合、細胞移植に伴うプロセスの遅延、あるいは懸濁液の形で移植された細胞の大幅な損失のいずれかについて言及することができます。したがって、懸濁液の形でケラチノサイトを移植することによる瘢痕の修正は不適切であるという結論に至りました。

ラットのケラチノサイト移植から2か月後のラットの瘢痕。

臨床像。傷跡は薄く繊細に見えます。ところどころに、皮剥けや鱗状の斑点が見られます。

顕微鏡写真。角質層は肥厚し、部分的に角質増殖が見られます。表皮は肥厚し、12～20列の細胞で構成されています。表皮と真皮の境界は直線です。表皮の下には繊細なコラーゲン繊維が密集しています。瘢痕の深層では、コラーゲン繊維は大きく粗い束に集まっています。表皮下層には新しい血管が形成されています。瘢痕組織の下層には、表皮の表面と平行に並ぶ多くの血管が見られます。大きな線維芽細胞が瘢痕の厚み全体に均一に分布し、巨大で多枝性のマクロファージが多数存在します。

ラットの表皮細胞を移植してから 5 か月後のラットの傷跡。

臨床像。瘢痕は均一で滑らかで、剥がれがなく、単毛が見られ、瘢痕の周辺部では毛の密度が高くなっています。これは、瘢痕の周辺部への毛包の侵入と新たな毛包の形成を示しています。瘢痕の面積は減少し続けています。

顕微鏡写真。表皮は依然として厚く（15～20層、場所によっては30層）、上層はケラトヒアリン粒子で満たされています。基底膜が明瞭に見えます。その下には、コラーゲン繊維が緩く横たわっています。下層では、コラーゲンはより強力で密集しています。コラーゲン束の間には、多くの毛細血管が見られます。上層では、放置された血管の数が減少しています。表皮と真皮の境界はわずかに波打っています。瘢痕組織には、深層部の表皮の突起が見られる箇所もあります。コラーゲン繊維の間には、新たに形成された血管が見られます。毛包と脂腺が単独で現れています。

ラット表皮 MPA 細胞移植後 9 か月のラットの瘢痕。

臨床像。瘢痕は以前と比べて著しく小さくなり、平均面積は約1.5～2.0cm²です^。瘢痕は、特に周辺部で細い毛で不均一に覆われています。軽度の薄板状剥離は残っています。

顕微鏡写真。

表皮は薄くなり、6～8列の細胞で表され、構造は正常なラットの皮膚の表皮に似ていますが、細胞密度が1 mm高く、細胞が小さいだけです。基底層は小さな円筒形の細胞で構成されています。基底膜はよく発現しており、ヘミデスモソームがはっきりと見えます。表皮下層に表皮の突起があることが認められます。乳頭層は瘢痕の全長に沿って発現しています。これらの事実は、この時点で移植されたケラチノサイトとその下の瘢痕組織との接着がはるかに強くなっていることを示しています。したがって、MPC移植後9か月のMPALK移植を受けた人の瘢痕ケアは、従来の方法でかまいません。表皮の下では、コラーゲン繊維は深層よりも繊細です。多くの血管、特に表層の血管が現れています。大きな血管の壁は厚くなっています。毛包と脂腺が大量に存在します。顕微鏡写真は真皮のような組織に似ています。

実験作業の結果とその考察。

本研究では、様々な形態のケラチノサイトを、皮膚剥離術後に人工的に作製したラットの皮膚瘢痕に移植しました。移植は、創傷被覆材、カンブリック上の懸濁液、そして基質のない多層膜の形で行いました。本研究は、移植された同種ケラチノサイトが瘢痕に及ぼす影響に関する形態学的データを取得し、最適な移植方法を決定することを目的として実施されました。

3つの移植方法はすべて実行可能であることが判明しましたが、基質なしでMPACを移植することは非常に手間のかかる作業であり、その過程でMPACが損傷する可能性があり、移植結果に影響を及ぼす可能性があります。さらに、この移植方法では広い面積での作業は不可能です。

ケラチノサイト懸濁液移植は、はるかに費用対効果の高い方法であり、長期間の細胞培養を必要とせず、私たちが提案する方法では、傷跡のサイズに対応するサイズの滅菌カンブリックブランクを使用するため簡単です。創傷被覆材へのMPC移植と比較して、細胞懸濁液を移植する場合の治療効果の約1か月の遅延は、治療期間が数ヶ月に及ぶ場合には大きな問題ではありません。火傷患者にMPCを移植すると、皮膚構造の変化は徐々に、数年かけて起こることが知られています。創傷被覆材へのケラチノサイト培養移植は、最も簡便で有望な方法ですが、大幅に高価でもあります。さらに、現在、柔軟性、吸湿性、静菌性または殺菌性、細胞に対して生物学的に中性である、より高度な被覆材の選択肢の探索が必要です。フィルム「ポリポール」は、国内のフィルム創傷被覆材の中間バージョンであり、いくつかの欠陥があるにもかかわらず、ラットのケラチノサイトの傷跡への移植の実験を研究し、この傷跡治療の方向性の有効性についての結論を導き出すことができました。

熱傷創にMPCを移植した著者らは、消毒した創傷に多層ケラチノサイトを移植後1週間で表皮が肥厚し、重層化したことを観察した。表皮のすべての層が明瞭に観察できた。興味深いことに、移植片の細胞層数は皮膚生検よりも10～30%多かった。著者らは、MPC移植後5日目にケラトヒアリン顆粒が、3日目には既に基底膜とヘミデスモソームが出現したことを指摘した。

J.Rivesら（1994）、Paramonov BA（1996）、Kuznetsov NMら（1998）は、火傷後の全層皮膚欠損患者へのMPC移植後の初期段階では、真皮と表皮の結合が非常に弱く直線状で、乳頭層が存在しないことを発見しました。2ヶ月目が終わる頃には、浅い乳頭と皮膚付属器が形成され始め、真皮と表皮の結合が強まります。文献データによると、火傷患者の創傷への同種ケラチノサイト移植は有望な治療法です。様々な著者によると、同種ケラチノサイトは10日から3ヶ月以内に拒絶反応を起こしますが、それでも創傷表面の治癒、成長因子の分泌、欠損の機械的閉鎖といった役割を果たします。 MPALCは、体外培養中にランゲルハンス細胞を失うため、抗原活性が低下し、レシピエントの体内で長期間生存できると考えられています。さらに、若く健康な人の皮膚から採取した同種培養は、外傷後の患者の自己培養に比べて、はるかに優れた生物学的ポテンシャルを有しています。

本研究の主な目的は、同種ケラチノサイトが瘢痕に定着するかどうか、そしてそのような生物学的に活性な「創傷被覆」の影響下で瘢痕組織にどのような変化が生じるかを明らかにすることです。良好な結果が得られた場合、リハビリテーション医療のこの分野において、最も効果的で労力の少ない技術を開発することが期待されます。

得られたデータは、火傷創への同種ケラチノサイト移植後にヒト表皮に生じる形態変化に関する文献データと多くの点で類似していました。しかしながら、移植が行われる形態学的基質と技術の両面において、大きな違いも存在します。例えば、瘢痕性変化を伴わない創面へのケラチノサイト移植と比較して、基底膜および真皮-表皮結合（ヘミデスモソーム、乳頭）の形成過程が遅い段階で起こります。これは、真皮や筋膜と比較して瘢痕組織の栄養状態が悪いことが原因であると考えられます。瘢痕、特に古い瘢痕は、血管が非常に少ない緻密な結合組織ですが、火傷創の底部は血管が豊富な肉芽組織です。したがって、ケラチノサイトの移植と生着が起こる条件が全く異なることは明らかです。細胞移植部位の血管が充実しているほど、生着プロセスは容易になります。この仮説から、結合組織がまだ緩く、血管が豊富な若い瘢痕を治療することが好ましいという結論が導き出されます。

この実験作業の結果、次のことが証明されました。

1. MPALK を傷跡に移植することも可能です。
2. 最適な移植方法は、創傷被覆材へのケラチノサイトの移植です。
3. 傷跡の表面は、外科用レーザー皮膚研磨法またはシューマンカッターを使用して研磨する必要があります。
4. MPALK の影響により、傷跡の研磨された表面の急速な上皮化が起こります。
5. 瘢痕組織の血管新生が良好であればあるほど、つまり瘢痕が若いほど、ケラチノサイト移植の結果は良好になります。
6. 移植されたケラチノサイトの影響により、瘢痕組織は徐々に変形し、真皮のような（皮膚の付属器を持つより緩い瘢痕組織）状態に変わります。
7. 表皮下層から瘢痕組織が徐々に緩んでいきます。血管新生が改善され、瘢痕の上部と下部のコラーゲン繊維束は、細胞移植を受けていない瘢痕組織よりも緩やかな配列になります。毛包と皮脂腺が出現します。表皮は肥大期を過ぎ、構造上、正常皮膚の表皮に近づきます。
8. 観察された変化は、ケラチノサイトによって分泌される成長因子とサイトカインに関連しており、瘢痕組織の栄養を改善することで、粗い線維組織からより緩い組織への変換を促進し、瘢痕の外観の改善につながります。

したがって、この研究に基づいて、移植されたケラチノサイトは瘢痕組織に有益な効果をもたらし、さまざまな種類の瘢痕を持つ患者のリハビリテーションに実際的な意味合いを持つ可能性があると結論付けることができます。

このラットを使った研究により、ケラチノサイトが増殖する創傷被覆材の要件を定式化することができました。

創傷被覆材は次の条件を満たす必要があります。

• 細胞と生体適合性があり、
• 通気性、
• 弾力性のある形状形成ベースを持ち、
• 親水性であること
• 医薬品添加物には培養細胞に毒性のない抗菌剤や抗酸化剤が含まれているためです。

バイオテクノロジーによる傷跡の治療の臨床結果。

以前、N. Carverら（1993）は、閉鎖性創傷被覆材は創傷への付着とケラチノサイトの生存を最も促進するが、重層（成熟）表皮の形成を阻害することを発見しました。重層表皮の形成には空気環境が必要です。そのため、多層被覆後、7～10日後に閉鎖性創傷被覆材を除去し、乾燥被覆材または水溶性軟膏を用いて創傷を治療することが提案されました。細胞が増殖する「基質」の品質と特性は、細胞材料移植の有効性、ひいては医師の作業結果にとって非常に重要なポイントであると言えます。しかし、現在、人工皮膚、カルボキシメチルセルロース製不織布、フィブリンコーティング、半透性ポリウレタンフィルムなど、様々な選択肢が提案されているにもかかわらず、理想的な創傷被覆材は存在しません。この問題の重要な点は「基質」（特殊な創傷被覆材）のコストです。その高コストにより、バイオテクノロジー治療の全体的なコストが増加するためです。

細胞技術の有効性はこれまでに実証されていますが、残念ながら、これらの技術は、特に細胞組成物の工業生産が確立されていない国では非常に高価です。しかしながら、米国などの国では、火傷移植用の細胞材料の製造産業が古くから確立されています。特に、BioSurface Technology社は1989年以来、37,000層の多層ケラチノサイト層を培養し、世界79カ国で240人の患者の治療に使用しました（R. Odessey, 1992）。一方、^細胞培養1cm²あたりのコストは約7～8米ドルです。

さまざまな皮膚疾患や皮膚の問題を治療する技術にはさまざまな違いがありますが、どの細胞治療も高品質の細胞材料を入手して移植することに基づいています。

このプロセスは次の手順で構成されます。

• 被害者（またはドナー）から皮膚を採取する
• 皮膚フラップをバイオテクノロジーセンターに輸送し、
• 基底層細胞の分離と増殖、
• 多層角質細胞層（MLK）の成長。
• 細胞培養移植。

多層角化細胞シート移植による治療を行う際の主な課題は、細胞移植のあらゆる段階で生存細胞が必要であることです。自己細胞または同種細胞を分離するための皮膚片は、可能な限り薄くする必要があります。これにより、機械的および酵素的方法を用いて分離しやすくなり、培養用の生細胞懸濁液を得ることができます。皮膚片は、皮膚切片、まぶた、包皮、肩甲骨の内側の皮膚から採取できます。細胞はハロゲン（塩素、ヨウ素）や過酸化水素に敏感であるため、材料採取時の皮膚処理には使用できません。

皮膚移植から得られる細胞の量的・質的収量、そして培養効率は、ドナーの健康状態と年齢にも左右されます。さらに、皮膚生検は、可能な限り迅速に、適切な条件（環境、温度）のもと、これらの目的のために認定・認可された検査室に送付する必要があります。

皮膚フラップの保管および輸送には、10% 牛血清を添加したイーグル培地または培地 199、5% 牛胎児血清および抗生物質を添加した DMEM 培地を使用できます。

細胞診検査室では、まず皮膚生検材料を機械的に小片に分割し、次に皮膚片をトリプシン、コラーゲナーゼ、ディスパーゼなどの酵素を使用して処理します。

酵素の作用により、デスモソームが破壊され、ケラチノサイトは個々の細胞または異なる数の細胞からなる凝集体の形で培地に放出されます。培養には基底ケラチノサイトのみが使用され、5％COを含むサーモスタット内の専用培地、ペトリ皿、またはフラスコ内でt = 37°Cで増殖します。48時間後には、ケラチノサイトのコロニーの形成が観察され、徐々に融合して単層になります。十分な数の細胞を採取した後、得られた懸濁液を、この目的のために調製された創傷被覆材に播種し、ペトリ皿に入れます。最初に、懸濁液からケラチノサイトの単層、次に多層層が形成されます。ケラチノサイトの培養プロセスの段階は、図12（33、43、54、65）に概略的に示されています。

移植に適した多層ケラチノサイト層の形成には通常7～10日かかります。この期間は、ドナーの年齢、健康状態、材料採取の正確さ、使用する培地の品質など、材料の品質に応じて長くなる場合もあります。多層ケラチノサイト層が過剰に増殖すると、移植に適さないアポトーシス現象を起こした細胞が表面に現れることがあります。創傷被覆材上に培養された多層ケラチノサイト層（MLK）が入ったペトリ皿は、専用の容器に入れられ、少なくとも+15℃の温度でクリニックに届けられます。

MPC の増殖のための改良グリーン法

本研究では、ラットを用いた実験で使用した「ポリポア」フィルムを放棄し、多層カンブリックを創傷被覆材として使用しました。これにより、脱脂・滅菌済みのカンブリック上に多層ケラチノサイト層を培養することができました。ただし、これも創傷被覆材として最適ではありません。

臨床試験は、同意書への署名とインフォームドコンセントなど必要な倫理基準に従ってボランティアを対象に実施されました。

1. 患者自身の（自家）角質細胞と保存された（同種）角質細胞の培養物が使用されました。
2. 患者自身の角質細胞は、上腕の内側から切り取った皮膚片から採取された。
3. 瘢痕皮膚剥離手術は、熱焼灼術、回転ディスク、エルビウムレーザーを使用して実施されました。
4. 正栄養性瘢痕、低栄養性瘢痕、および肥厚性瘢痕を持つ患者のグループが対象となりました。

細胞技術を応用して皮膚の傷跡の外観を改善する技術プロセスは、次の段階で構成されています。

1. 患者の選択。
2. 治療の本質、期待される結果が得られるまでの期間、契約書への署名、インフォームドコンセントの説明。
3. 手術の2～3週間前に患者にセルメビット1錠を1日3回、ジンクセラル1錠を1日3回処方します。
4. 肩の内側表面から、腋窩領域のほぼ下部の高さで、長さ 2.0 cm、幅 0.7 ～ 1.0 cm の皮膚片を採取し、自己角化細胞を採取します。
5. 肩の内側表面に線状の傷跡が残る可能性があるため、患者が自身の角質細胞の分離を拒否した場合、細胞バンク（同種角質細胞）から細胞材料が採取されました。
6. ケラチノサイトは、この種の作業のために認定された研究室で分離され、培養されました。
7. 傷跡に移植するのに十分な量の MPC を採取した後、クリニックで手術の日取りが決定し、材料はペトリ皿内の特別な容器に詰められて運ばれました。
8. 瘢痕削皮術を実施し、止血を行った後、研磨面を滅菌生理食塩水で洗浄し、乾燥させた後、MPCを「細胞を下にして」滅菌カンブリック上に移植しました。つまり、MPCの上部にあった細胞は、研磨面に隣接する下部に位置することになります。
9. その上に滅菌フィルムを貼り、弾性包帯またはオムニフィックス絆創膏で皮膚に固定します。フィルムの代わりに、メピテル、メピフォーム、シリコーンゲルシートなど、シリコーンを含む創傷被覆材を使用することもできます。

5～7日後、フィルムまたはシリコンコーティングが除去されます。この頃には、すべてのケラチノサイトが研磨された傷跡に這い上がり、表面に付着しているはずです。

10. フィルムとシリコンコーティングの下に形成される湿潤環境が、この治癒に大きく貢献します。この時点から傷跡に残るカンブリックは、キュリオシンまたはキトサンゲルに浸すことができます。その結果、2日目には緻密な痂皮が形成されます。患者の利便性を考慮し、オムニフィックスなどの伸縮性と通気性に優れたパッチで固定するのが最適です。この通気性のある痂皮によって、形成された表皮は分化し、成熟した表皮へと変化します。

傷跡の種類と擦過傷の深さにもよりますが、包帯は8～10日後には拒絶反応を起こします。この時点では、表皮の細胞層は正常な皮膚よりも30～40%多くなっています。基底膜は形成されていません。肥厚した表皮のケラチノサイトは、瘢痕組織に多くの生理活性分子を分泌します。

バイオテクノロジーによる瘢痕治療の成功は、術後のケア方法に大きく左右されます。細胞培養は「優しい」タイプの創傷被覆材であり、移植後初期にはIPCが下層組織から容易に剥がれてしまう可能性があります。そのため、術後は傷跡を丁寧に扱うことが推奨されます。8～9ヶ月間は、擦らず、冷水で優しく処置してください。新しくできた薄い表皮は下層組織としっかりと結合していないため、剥がれてしまう可能性があります。

注記。

手術前および皮膚剥離中は、ハロゲン系消毒剤および酸化剤（ヨードピロン、スリオドピロン、ヨージノール、ヨウ素酸塩、クロルヘキシジン、過酸化水素）の使用は許容されますが、細胞移植前は細胞毒性があるため厳禁です。メチレンブルーとブリリアントグリーンも細胞毒性があります。

感染を防ぐため、特に肥厚性瘢痕の治療においては、術野を硫酸ネオマイシン、ポリミキシン、またはゲンタマイシンで処理することができます。これらの薬剤はケラチノサイトに対して細胞毒性作用を持ちません。

このような治療の結果、3つの効果が得られます。

1. 傷跡の表面を平らにする。
2. その上に通常の厚さの新しい表皮層を作成します。
3. 移植細胞によって分泌され、角質細胞、線維芽細胞、マクロファージに刺激を与えるサイトカイン、成長因子、その他の生物学的に活性な分子の作用により、瘢痕組織が真皮のような組織に変化します。

傷跡は目立たなくなり、弾力性が増し、傷跡に毛穴と産毛が現れ、IPC 内のメラノサイトの存在により色素沈着が回復します。

しかし、傷跡のこれらの良い側面はすべてすぐに現れるわけではありません。この点で、瘢痕組織が真皮組織に変化するプロセスはゆっくりと進行し、この治療の最適な結果は10～14ヶ月後に期待できることを患者に警告する必要があります。ドレッシングの除去直後、研磨面は顕著な多色性を示し、より明るいほど研磨が深く行われます。エルビウムレーザーで正栄養性瘢痕を研磨すると、皮膚へのダメージが最も少なくなります。傷跡と周囲の皮膚の色は3～8週間以内に回復します。このような予防措置にもかかわらず、術後に色素沈着が起こることがありますが、これは数ヶ月以内に自然に消失することがあります。

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